[发明专利]一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法

权利要求书

1.一种检测血红蛋白类氧载体中碳酸酐酶的酶活性的方法，包括以下步骤：

(1)向N个酶活性已知但不同的碳酸酐酶标准品中加入缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n，建立反应液n的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率k的标准工作曲线；

其中，所述反应底物包含二氧化碳；

(2)向待测样品中加入步骤(1)中的缓冲溶液、反应底物和酸碱指示剂，得到反应液n₀，建立反应液n₀的吸光度与反应时间的关系曲线，得到反应速率k₀；

(3)根据反应速率k₀和标准工作曲线，得到待测样品中碳酸酐酶的酶活性。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤(1)中待测样品为牛血或血红蛋白类氧载体原液稀释液；和/或步骤(1)中缓冲溶液为Tris-HCl缓冲溶液；和/或步骤(1)中反应底物为二氧化碳饱和溶液；和/或步骤(1)中酸碱指示剂为溴百里酚蓝。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤(1)中缓冲溶液的pH为6.50-8.30，优选为7.60-8.30；和/或步骤(1)中缓冲溶液的浓度为0.01mol/L-0.03mol/L，优选为0.015-0.025mol/L。

4.根据权利要求1-3任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中酸碱指示剂的浓度为0.01g/L-0.03g/L，优选为0.012g/L-0.02g/L。

5.根据权利要求1-4任意一项所述的方法，其特征在于：在波长570nm-650nm，优选为600nm-630nm，更优选为610nm-630nm，最优选为617nm处测量吸光度。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(1)中N为不小于3的正整数，优选为5-10之间的正整数；和/或碳酸酐酶标准品的酶活性为0U/mL-200U/mL，优选为0U/mL-100U/mL。

7.根据权利要求1-6任意一项所述的方法，其特征在于：步骤(2)中，待测样品为使用pH为7.35-7.45的磷酸钾盐缓冲溶液稀释40-60倍后的牛血；或待测样品为使用pH为7.35-7.45的磷酸钾盐缓冲溶液稀释15-30倍后的血红蛋白类氧载体原液。

8.根据权利要求1-7任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中以反应时间T(s)为横坐标，吸光度值A为纵坐标作图，所得直线的斜率为反应速率k；所述步骤(2)中以反应时间T(s)为横坐标，吸光度值A为纵坐标作图，所得直线的斜率为反应速率k₀。

9.根据权利要求1-8任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(1)中以反应速率为横坐标，CA标准品的酶活性为纵坐标作图，建立碳酸酐酶标准品的酶活性与反应速率的标准工作曲线。

10.根据权利要求1-9任意一项所述的方法，其特征在于：所述步骤(2)中选取反应时间为0s-16s，优选为2s-6s处的吸光度值作图。