[发明专利]一种葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用

说明书

本发明主要利用定点突变技术构建来源于特异腐质霉的β‑葡萄糖苷酶的突变体菌株，获得了一种葡萄糖耐受能力提高的β‑葡萄糖苷酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。相同条件下，本发明突变体可在400mmol/L葡萄糖的激活下最高达到249.61％的相对活力，在葡萄糖浓度为2mol/L时，其相对活力仍能达到98.37％，具有良好的葡萄糖耐受能力。本发明中的突变体在生物燃料、食品保健和生物合成等领域具有较高的应用价值。

技术领域

本发明属于微生物与基因工程技术领域，具体涉及一种葡萄糖耐受性提高的β-葡萄糖苷酶突变体及其应用。

背景技术

β-葡萄糖苷酶(β-Glucosidases EC 3.2.1.21)，全称β-D-葡萄糖苷水解酶，属水解酶类，又称纤维二糖酶、龙胆二糖酶或苦杏仁苷酶。该酶可以水解结合于末端的非还原性的β-D-糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖以及相应的配基。β-葡萄糖苷酶因对多种糖苷类化合物具有水解活性，可作用于多种生物活性物质，其水解产生的配基多为功能性苷元或芳香成分；有的β-葡萄糖苷酶还具有转糖苷活性，可转化生成功能性低聚糖，因此在食品保健，生物能源等领域具有广阔的应用前景。

由于在实际生产过程中，酶常处于不利环境，β-葡萄糖苷酶受到产物-葡萄糖的影响，导致生产效率低下，底物反映不充分等问题的出现。通常采用增加酶量、同步糖化发酵法(SSF)等措施来缓解产物的抑制作用，但这些方法工艺复杂，污染大、成本较高。为使催化反应高效地进行，目前亟需获得具有高耐受葡萄糖的β-葡萄糖苷酶。同时葡萄糖耐受性作为β-葡萄糖苷酶的关键性质在生物燃料、食品保健和生物合成等生产过程中也越来越受到重视。具有高耐受性的β-葡萄糖苷酶因可降低葡萄糖对酶活力的抑制作用，而显示出独特的应用潜能。CN102220302A以来自海洋未培养微生物来源的β-葡萄糖苷酶为基础，通过PCR定点突变，获得突变基因，相对野生型β-葡萄糖苷酶蛋白，获得的突变蛋白的葡萄糖耐受浓度提高了13倍。CN103266096A通过将β-葡萄糖苷酶基因Pbgl的386位的色氨酸突变成半胱氨酸，得到β-葡萄糖苷酶突变体Pbgl-W386C，葡萄糖的耐受性是突变前的11.88倍，提高了10.88倍。CN105754973A通过将链霉菌的β-葡萄糖苷酶S-bgl6分子上的233位色氨酸突变成天冬氨酸而得到β-葡萄糖苷酶突变体，和突变前相比，葡萄糖的耐受性提高了208.9倍。CN107142254A将来源于嗜酸耐热脂环酸芽孢杆菌Alicyclobacillus sp.A4的β-葡萄糖苷酶的315位氨基酸由组氨酸突变为精氨酸，得到较高葡萄糖耐受性β-葡萄糖苷酶突变体，在相同条件下，葡萄糖对突变体和野生型的酶活促进作用分别为212％和163％。

发明内容

针对当前产业需求和现有技术的不足，本发明主要目的是通过定点突变技术构建一种具有良好的葡萄糖耐受性的β-葡萄糖苷酶突变体。

为了实现上述目的，本发明采取如下的技术方案：

第一方面，本发明提供一种β-葡萄糖苷酶突变体，所述β-葡萄糖苷酶突变体的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

第二方面，本发明提供编码所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因。

第三方面，本发明提供包含所述β-葡萄糖苷酶突变体的基因的载体。

第四方面，本发明提供包含如上所述基因或载体的重组菌株。

第五方面，本发明提供如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的用途，其用于水解糖苷或寡糖化合物非还原性末端的β-D-葡萄糖苷键，产生β-D-葡萄糖与相应配基；并且，所述突变体相比野生型具有提高的葡萄糖耐受性。

第六方面，本发明提供制备如上所述β-葡萄糖苷酶突变体的方法，该方法通过利用本发明所述β-葡萄糖苷酶突变体的编码基因或本发明所述载体进行基因重组和表达。