[发明专利]一株产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用

说明书

本发明提供一株产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用。所述重组裂殖壶菌含有来来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因GGH、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT、和来源于镰孢菌的γ‑生育酚甲基转移酶基因γ‑TMT。采用本发明的重组裂殖壶菌进行发酵培养合成生育酚，生育酚的产量可达到126.5μg/g DCW，其中γ‑生育酚含量达到82.3μg/g DCW，α‑生育酚含量达到44.2μg/g DCW，成功地在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径并实现了较高产量。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一株产生育酚的重组裂殖壶菌，还涉及所述重组菌株的构建方法，及其在生产生育酚中应用。

背景技术

生育酚(tocopherol)属于维生素E(Vitamin E)的一个类型，其主要来源于植物种子的油脂中，生育酚和生育三烯酚具有抵抗日常膳食中脂类物质被氧化的能力，这种能力通常被定义为为“维生素E活性”。维生素E的应用领域非常广泛，可以添加在化妆品、护肤品中，还可以作为医疗保健品预防各种疾病，在动植生命中有着不可替代的重要地位，故而人类对维生素E的需求量巨大。但是目前的一些化学合成、生物提取的方法存在收率低、纯度不高、浪费较大、易污染环境、设备昂贵、操作复杂及质量差等问题。因此，通过生物技术手段调控一些关键酶基因的表达，成为天然生育酚合成的新途径。

裂殖壶菌(Schizochytrium)属于破囊壶藻科，是一类海洋异养微生物，以裂殖的方式进行繁殖，其单细胞内能够积累大量对人体有益的活性物质，如油脂、色素(类胡萝卜素、叶黄素和虾青素等)、角鳖烯等，这类物质的合成所用到的共同前体物质乙酰辅酶A在裂殖壶菌中含量比较高，这也是这类活性物质能大量积累的原因。生育酚合成的一个前体物质是植基二磷酸(PDP)，而植基二磷酸是由香叶基香叶基二磷酸(GGPP)在4-羟苯丙酮酸二加氧酶(HPPD)的作用下合成的，香叶基香叶基二磷酸同时也是类胡萝卜素合成的前体物质，所以我们尝试在类胡萝卜素合成通路的基础上构建生育酚合成通路，寻找天然生育酚合成的新途径。

本专利通过对生育酚合成途径中关键酶基因的挖掘，在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径，得到一株能合成生育酚的裂殖壶菌重组菌株。

发明内容

本发明的目的是在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径，同时进行生育酚合成途径中关键基因的挖掘，提供一种产生育酚的重组工程菌株，以及该重组菌株的构建方法和应用。

本发明的思路是通过筛选能够在裂殖壶菌中成功表达的生育酚合成基因，在裂殖壶菌中构建生育酚异源合成途径，得到一株能合成生育酚的裂殖壶菌重组菌株。

基于此，本发明提供一株重组裂殖壶菌，所述重组裂殖壶菌含有来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT、和来源于镰孢菌的γ-生育酚甲基转移酶基因γ-TMT。

在本发明中，所述来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述基因HPT的核酸序列如SEQ ID No.2所示，所述基因γ-TMT的核酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明还提供上述重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

(1)构建含来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因、HPT基因以及γ-TMT基因的重组质粒

获取来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT和来源于镰孢菌的γ-生育酚甲基转移酶基因γ-TMT的序列，合成并添加酶切位点，并在序列末端连接EGFP基因；将合成片段与质粒pBluZeo-18S分别经酶切和连接构建重组质粒pBluZeo-18S-AtGGPR、pBluZeo-GaHPT-18S和pBluZeo-Ftγ-TMT-18S，将所得重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子并测序验证正确；

(2)重组质粒转化裂殖壶菌