[发明专利]一株产生育酚的重组裂殖壶菌、其构建方法及应用

权利要求书

1.一株重组裂殖壶菌，其特征在于重组裂殖壶菌含有来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT、和来源于镰孢菌的γ-生育酚甲基转移酶基因γ-TMT；所述来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因的核酸序列如SEQ ID No.1所示，所述基因HPT的核酸序列如SEQ ID No.2所示，所述基因γ-TMT的核酸序列如SEQ ID No.3所示。

2.权利要求1所述的重组裂殖壶菌的构建方法，所述方法包括以下步骤：

（1）构建含来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因、HPT基因以及γ-TMT基因的重组质粒

获取来源于拟南芥的香叶基香叶基二磷酸还原酶基因、来源于小球藻的尿黑酸植基转移酶基因HPT和来源于镰孢菌的γ-生育酚甲基转移酶基因γ-TMT的序列，合成并添加酶切位点，并在序列末端连接EGFP基因；将合成片段与质粒pBluZeo-18S分别经酶切和连接构建重组质粒pBluZeo-18S-AtGGPR、pBluZeo-GaHPT-18S和pBluZeo-Ftγ-TMT-18S，将所得重组质粒热激转化大肠杆菌感受态细胞，筛选阳性转化子并测序验证正确；

（2）重组质粒转化裂殖壶菌

将上述重组质粒酶切线性化处理后，取10μl加入100μl裂殖壶菌ATCC 20888感受态细胞，混匀后转移至预冷的电转杯，冰上静置30min后进行电击，电击结束后立即加入1ml预冷的含1M山梨醇的种子培养基，轻轻混匀后转移至预冷的含1M山梨醇的4mL 种子培养基中，28℃、200rpm培养2h；然后取300μL菌液均匀涂于含50μg/mL博来霉素的固体平板，置于28℃培养箱培养24h，所得单菌落提取基因组进行 PCR验证并验证正确；

（3）构建重组裂殖壶菌ATCC-20889

将步骤（2）中验证成功的重组质粒pBluZeo-AtGGPR-18S，pBluZeo-GaHPT-18S，pBluZeo-Ftγ-TMT-18S中的AtGGPR，GaHPT和Ftγ_TMT片段通过酶切连接，然后连在质粒pBluZeo-18S上获得重组质粒pBluZeo-AtGGPR-GaHPT-Ftγ_TMT-18S，酶切线性化处理后，电击法转入裂殖壶菌中，获得重组菌株ATCC-20889。

3.权利要求1或2所述的重组裂殖壶菌在生产生育酚中的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所得重组裂殖壶菌在种子培养基中，180-220rpm、27-29℃恒温摇床里培养48-72h，然后以3-6%的接种量接入发酵培养基中，180-220rpm、27-29℃恒温摇床里培养3-5d；

所述种子培养基含有：葡萄糖 40g/L、酵母膏2g/L、谷氨酸钠10g/L、KH₂PO₄ 4g/L、NaCl15g/L、MgCl₂ 3g/L、CaCl₂·2H₂O 1g/L、 KCl 2g/L、MgSO₄·7H₂O 5g/L、FeCl₃0.1g/L；

所述发酵培养基含有：葡萄糖40g/L、酵母膏2g/ L、谷氨酸钠10g/L、KH₂PO₄ 4g/L、NaCl15g/L、MgCl₂ 3g/L、(NH₄)₂SO₄ 6g/L、KCl 2g/L、MgSO₄· 7H₂O 5g/L、FeCl₃ 0.1g/L。