[发明专利]用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组和检测试剂盒

说明书

本发明提供一种用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组和检测试剂盒。本发明以pbr1基因作为鼻疽诺卡菌的目标检测基因，设计并合成LAMP引物，将LAMP扩增技术和CRISPR‑Cas12a检测技术联合用于鼻疽诺卡菌的检测，通过在引物FIP或BIP的连接区插入PAM位点序列TTTA，使本方法不受PAM位点的限制。本发明提供的检测方法仅需简单的恒温金属浴或水浴，以及便携式荧光读取仪或一次性便携式试纸条即可完成检测，无需复杂的精密仪器，尤其适合现场和床旁检测。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，具体地说，涉及一种用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组和检测试剂盒。

背景技术

诺卡菌是需氧、部分抗酸、革兰氏阳性杆菌，被认为是急性或慢性肺部感染或化脓性疾病患者中常见的条件致病菌。鼻疽诺卡菌（Nocardia farcinica）是引起肺诺卡菌病的最常见病原体之一。将诺卡菌鉴定到种水平在临床诊治中具有重要意义，因为不同种诺卡菌具有不同的耐药谱。此外，鼻疽诺卡菌与戈登菌、红球菌和快速生长的分枝杆菌在表型上有一些相似之处，这可能导致对感染病原体的误判，进而导致误诊。对于许多诺卡菌病患者来说，误诊会使得病程延误或治疗不当，而导致高死亡率。鼻疽诺卡菌的培养通常需要2~7天，这给以培养为基础的鉴定方法（如MALDI-TOF MS等方法）带来了困难，因此，亟需建立一种不依赖于培养的，简单、快速、准确的诊断方法。

2004年，June M. Brown等人开发了一种以长度为314 bp种特异性DNA片段为检测靶标的PCR方法，以鉴定鼻疽诺卡菌临床分离株。2007年，Taichi等人建立了一种以nfa29510基因和部分非开放阅读框基因为检测靶标的PCR方法，以鉴定鼻疽诺卡菌。然而这些方法的结果判读依赖于琼脂糖凝胶电泳，非特异性扩增条带的出现会影响对于结果的判读，且PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳均需要特定的仪器，因此在现场快速检测应用中受到很大的限制。

环介导等温扩增（LAMP）是Notomi等人在2000年开发的一种特异、高效、快速的方法，在单一温度下1小时内即可完成对靶标序列的扩增。LAMP引物一般为针对8个目标序列区域设计的6条引物组成，包括2个内侧引物FIP和BIP，2个外侧引物F3和B3，以及2个环引物LF和LB。LAMP为现场快速诊断提供了更多的可能性。然而，由于交叉污染、非特异性扩增或引物二聚体形成等原因，仅用LAMP扩增进行检测可能会出现假阳性结果。

近年来，规律成簇的间隔短回文重复序列(CRISPR)/CRISPR相关蛋白(CRISPR/Cas)系统为基因编辑和转录调控等新的生物技术应用打开了大门。同时，具有反式切割活性的Cas蛋白的发现，也为新一代核酸检测平台的开发提供了极大帮助。例如，基于Cas12的DETECTR检测平台和HOLMES一小时低成本多用途高效系统已被用于人类乳头瘤病毒(HPV)和单核苷酸多态性的检测。类似地，基于Cas13的SHERLOCK检测平台和基于Cas14的DETECTR也被开发出来用于检测细菌、病毒和真菌。这些基于CRISPR的检测方法由于增加了CRISPRRNA（crRNA）对靶标序列的识别，因而比单独的特异序列扩增法（如PCR、LAMP等）具有更高的特异性，即使存在单碱基突变也可以被检测出来。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组和检测试剂盒。

本发明构思如下：以pbr1基因作为鼻疽诺卡菌的目标检测基因，设计并合成LAMP引物，将LAMP扩增技术和CRISPR-Cas12a检测技术联合用于鼻疽诺卡菌的检测。

为了实现本发明目的，第一方面，本发明提供一种用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组，所述LAMP引物组为：

外侧正向引物F3：5’- GCGGTGAGCAGTGACGT -3’；