[发明专利]用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组和检测试剂盒

权利要求书

1.用于检测鼻疽诺卡菌的LAMP引物组，其特征在于，所述LAMP引物组为：

外侧正向引物F3：5’- GCGGTGAGCAGTGACGT -3’；

外侧反向引物B3：5’- ACCCGGCACCAGGAGT -3’；

内侧正向引物FIP：5’- CCATGTCGTAGGCGACCAGCTCGCCACCATGCGGAAAC -3’；

内侧反向引物BIP：5’- AGTGTGCGCGACGAACAACCGGCGCCATGGTGGGGTT -3’；

环引物LF：5’- GAGACCGCGTTGTCCCC -3’；

环引物LB：5’- ACGCTGACGATGGCACT -3’。

2.基于CRISPR-Cas12a技术的鼻疽诺卡菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物组、crRNA、Cas12a蛋白、荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针；且在LAMP引物组的引物FIP或BIP中引入PAM位点；或者，

所述试剂盒包含权利要求1所述的LAMP引物组、crRNA、Cas12a蛋白、荧光基团和生物素双标记的单链DNA探针；且在LAMP引物组的引物FIP或BIP中引入PAM位点；

其中，crRNA的序列为：5’- UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUUCGCCACCAUGCGGAAACGGCU -3’；

单链DNA探针的序列为：5’- TTTATTTATTT -3’。

3.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，引入PAM位点的引物FIP的核苷酸序列为：5’- CCATGTCGTAGGCGACCAGCTCGCCACCATGCGGAAAC-3’。

4.根据权利要求2或3所述的试剂盒，其特征在于，在单链DNA探针的5’端修饰6-FAM或FITC基团，3’端修饰BHQ1；或者，

在单链DNA探针的5’端修饰6-FAM或FITC基团，3’端修饰生物素。

5.基于CRISPR-Cas12a技术的鼻疽诺卡菌核酸检测方法，其特征在于，所述方法为非疾病诊断目的，包括以下步骤：

1）提取待测样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用权利要求2-4任一项所述试剂盒中的LAMP引物组进行LAMP扩增反应；

3）将步骤2）的扩增产物与反应缓冲液、crRNA和Cas12a蛋白形成的复合物以及荧光基团和荧光淬灭基团双标记的单链DNA探针混合，反应一段时间后进行荧光强度检测。

6.基于CRISPR-Cas12a和侧流层析技术的鼻疽诺卡菌核酸检测方法，所述方法为非疾病诊断目的，其特征在于，包括以下步骤：

1）提取待测样品中的DNA；

2）以步骤1）中提取的DNA为模板，利用权利要求2-4任一项所述试剂盒中的LAMP引物组进行LAMP扩增反应；

3）将步骤2）的扩增产物与反应缓冲液、crRNA和Cas12a蛋白形成的复合物以及荧光基团和生物素双标记的单链DNA探针混合，反应一段时间后，将反应产物加到侧流层析检测试纸条上，并滴加2~3滴运行缓冲液，使反应产物在毛细管作用下沿试纸条流动，2分钟内观察显色结果。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述侧流层析检测试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸收垫组成；

其中，结合垫包被有链霉亲和素修饰的纳米金颗粒；

硝酸纤维素膜上设有检测线和质控线，检测线包被有生物素化牛血清白蛋白，质控线包被有抗羧基荧光素抗体或抗异硫氰酸荧光素抗体。