[发明专利]普鲁兰酶突变体、工程菌及其应用

说明书

本发明公开了一种普鲁兰酶突变体、工程菌及其应用，所述普鲁兰酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第365位、第401位、第504位或第499位氨基酸进行单突变或多突变获得的。本发明构建的普鲁兰酶突变体的催化活性、热稳定性与耐酸稳定性均得到了提高，其中突变体PulAR‑A365V‑401C‑H499A‑T504V的催化效率较野生型普鲁兰酶PulAR在pH5.0、6.0，60℃条件下分别提高了6.6倍与9.6倍；在60℃，65℃的半衰期分别比野生型普鲁兰酶提高了2.6和3.1倍，且在pH 4.5与pH 5.0的半衰期分别比野生型普鲁兰酶提高了1.6和1.8倍。

(一)技术领域

本发明涉及一种普鲁兰酶，特别涉及一种通过定点突变与组合突变的方法构建普鲁兰酶PulAR突变体，并用于制备热稳定性和耐酸性提高的普鲁兰酶。

(二)背景技术

普鲁兰酶(Pullulanase,EC 3.2.1.41)是一种淀粉脱支酶，能够专一性地断开普鲁兰糖、可溶性淀粉、支链淀粉和一些寡聚糖中的α-1,6糖苷键。普鲁兰酶广泛应用于糖化步骤，与糖化酶或β-淀粉酶协同作用，提高糖化效率，减少糖化酶或β-淀粉酶的使用量，从而提高生产量，降低生产成本的目的。

为了最大化发挥普鲁兰酶和糖化酶或β-淀粉酶之间的协同效应，普鲁兰酶与糖化酶、β-淀粉酶需具有一致的作用温度。工业生产中为了达到糖化酶等的最大催化效率、减少染菌的机率，糖化过程温度和pH一般控制在60℃、pH 4.5-5.0，反应时间达到48小时以上。因此，耐热耐酸的普鲁兰酶亟需开发。然而大部分的从自然界中挖掘到的普鲁兰酶通常不具备在高温、酸性的条件下能够保持高活性和高稳定性。而且目前国内的普鲁兰酶市场被美国杰能科公司垄断，因此仍需对普鲁兰酶加大开发力度，摆脱对进口普鲁兰酶产品的依赖。

得益于生物信息学、基因组学和蛋白质组学等前沿生物技术的快速发展，以及随着人们对普鲁兰酶晶体结构与功能关系的解析、酶催化机制等的深入研究。发明人前期从嗜热菌厌氧芽孢杆菌中克隆并表达了I型普鲁兰酶PulAR，该酶的最适作用条件为55℃、pH6.0，但催化效率较低。本发明通过蛋白质工程技术，构建催化温度、热稳定性、耐酸稳定性与催化效率显著改善的普鲁兰酶PulAR突变体，促进淀粉酶法水解技术工艺发展。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种普鲁兰酶PulAR突变体、工程菌及其应用，提升普鲁兰酶PulAR的催化活性、热稳定性与耐酸稳定性，解决野生型普鲁兰酶PulAR在高温、酸性条件下的催化活性低、稳定性差的问题。

本发明采用的技术方案：

本发明提供一种普鲁兰酶PulAR突变体，所述普鲁兰酶PulAR突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列的第365位、第401位、第504位或第499位氨基酸进行单突变或多突变获得的。本发明所述普鲁兰酶PulAR突变体是对普鲁兰酶PulAR基因(SEQ ID NO.2)进行定点突变与组合突变，将获得的突变质粒以热击的方式转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，对获得菌株进行接种、转接、诱导，获得普鲁兰酶PulAR突变体蛋白。

本发明首先将野生型普鲁兰酶PulAR的重组菌E.coli BL21(DE3)/pET32a(+)-PulAR活化并提取质粒，并保存于-20℃。其次通过同源建模，获得待改造的普鲁兰酶的三维结构，选择位于活性中心附近的氨基酸残基，同时根据PulAR与耐酸普鲁兰酶的序列比对，确定了7个关键性氨基酸Q355、A365、T399、V401、Y491、H499与T504。以pET32a-PulAR基因为模板质粒，进行定点突变，获得突变质粒后，并转化，进行优势突变菌的筛选，获得正突变并进行叠加突变，筛选优势突变体。