[发明专利]普鲁兰酶突变体、工程菌及其应用

权利要求书

1.一种普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述普鲁兰酶突变体是将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第365位、第401位、第504位或第499位氨基酸进行单突变或多突变获得的。

2.如权利要求1所述普鲁兰酶突变体，其特征在于，所述普鲁兰酶突变体是将SEQ IDNO.1所示氨基酸序列突变为下列之一：(1)第365位丙氨酸突变为缬氨酸；(2)第401位缬氨酸突变为半胱氨酸；(3)第504位苏氨酸突变为缬氨酸；(4)第499位组氨酸突变为丙氨酸；(4)第365位丙氨酸突变为缬氨酸、第401位缬氨酸突变为半胱氨酸；(5)第365位丙氨酸突变为缬氨酸、第401位缬氨酸突变为半胱氨酸、第504位苏氨酸突变为缬氨酸；(6)第365位丙氨酸突变为缬氨酸、第401位缬氨酸突变为半胱氨酸、第504位苏氨酸突变为缬氨酸、第499位组氨酸突变为丙氨酸。

3.一种含权利要求1所述普鲁兰酶突变体的编码基因的重组载体。

4.一种含权利要求3所述重组载体的重组基因工程菌。

5.如权利要求4所述的重组基因工程菌，其特征在于，所述重组基因工程菌按如下方法构建：将普鲁兰酶突变体连入pET 32a(+)的EcoR V与Xho I位点，转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得所述的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述普鲁兰酶突变体在制备普鲁兰酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用为：将普鲁兰酶突变体重组基因工程菌诱导培养后，取湿菌体用缓冲液重悬，超声破碎，破碎液再进行镍柱纯化，获得普鲁兰酶蛋白。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述普鲁兰酶突变体重组基因工程菌诱导培养方法为：将普鲁兰酶突变体重组基因工程菌接种到含有50μg/mL卡钠霉素与100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃，220rpm活化培养过夜，获得种子液；将种子液以体积浓度1-5％转接到含50μg/mL卡钠霉素与100μg/mL氨苄抗生素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养至发酵液OD值达到0.6-0.8后，加入终浓度为0.15mM的IPTG，低温16℃继续诱导培养20小时；发酵液4℃、12，000rpm离心10min，收集湿菌体。

9.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述普鲁兰酶蛋白按如下方法制备：(1)将湿菌体悬浮于50mM、pH 7.5的PBS缓冲液，利用超声破碎仪破碎细胞10min，破碎条件：功率为350W，破碎1s，暂停1s；然后4℃、12，000rpm离心30min，收集上清，制得粗酶液；(2)将粗酶液在4℃、8000rpm条件下离心10min，去沉淀，上清液经0.22μm的滤膜过滤后，滤液作为上样液，以0.25mL/min速度上样镍柱，上样量为有效柱体积的2％；先用冲洗缓冲液洗脱杂蛋白，流速1mL/min，洗脱量为5-10个柱体积，洗脱至基线平衡，使得杂蛋白完全被冲洗掉；再用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，流速为1mL/min，通过观察检测器紫外吸收值进行监测，当紫外吸收值相对于基线向上扬起时用试管收集洗脱液，当紫外吸收值回到基线时停止收集，将收集到的洗脱液装入透析袋，置于pH 7.0、20mM的PBS溶液中4℃透析12h，透析后截留液即为普鲁兰酶蛋白纯酶液；所述冲洗缓冲液为含0.3M NaCl和20mM咪唑的20mM，pH7.0的磷酸钠缓冲液；所述洗脱缓冲液为含0.3M NaCl和500mM咪唑的20mM，pH 7.0的磷酸钠缓冲液。

10.一种权利要求1所述普鲁兰酶突变体在淀粉糖化中的应用。