[发明专利]一种山梨糖还原酶OpCR基因、突变体及编码蛋白和在制备玻色因中的应用

说明书

本发明公开了一种山梨糖还原酶OpCR基因、突变体及编码蛋白和在制备玻色因中的应用。该OpCR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其编码的蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，突变体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3～5所示。本发明中β‑丙酮木糖苷可立体专一性地还原得到玻色因，还避免使用污染、危险的化合试剂，可实现玻色因绿色生产制造，克服了现有路线中工艺放大困难、危险废弃物多等缺点，同时大大降低了生产成本。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种山梨糖还原酶OpCR基因、突变体及编码蛋白和在制备玻色因中的应用。

背景技术

玻色因（Pro-Xylane^TM），化学名为羟丙基四氢吡喃三醇（CAS：439685-79-7），是一种具有抗衰老活性的木糖衍生物，常用于化妆品中。玻色因(Pro-Xylane^TM)于2006年9月成功上市。研究表明玻色因具有广泛的生物活性，玻色因可直接影响皮肤三层结构中的细胞外基质，可以激活或促进皮肤中黏多糖(GAGs)的合成，改善真皮与表皮间的黏合度，促进受损组织的再生，帮助维持真皮的弹性，可有效地保持皮肤紧致、细腻，延缓皮肤的衰老。此外，玻色因还可促进透明质酸和胶原蛋白生成。玻色因易于生物降解，不会在生物体内积累，没有毒性。目前，生产玻色因的方法主要有两种，一种是化学合成法。另一种方法是生物合成方法。

国外的化学合成法是以木糖为原料，在碱性条件下，与2,4-戊二酮缩合反应12 h，经强酸性阳离子交换树脂酸化，再用硼氢化物对羰基还原反应12 h，合成玻色因。还有的方式也是以木糖为原料，在碳酸氢钠作用下，与2,4-戊二酮进行缩合反应，转换为C-糖苷，再用重金属催化剂Ru/C对羰基还原，合成玻色因。该合成方法产率高，但NaOH溶液腐蚀性大，对反应器材质的要求高，对环境有污染，所产生三废治理花费高；此外，该法还存在还原选择性低，使用硼氢化钠造成污染，且产物难以提纯等缺点。

国内在此路线上进行了改进，第一步是以木糖为原料，采用强碱性阴离子树脂代替了普通的无机碱，第二步再用硼氢化钠对羰基进行还原，合成玻色因。但由于这两步反应的产物均采用了柱层析纯化，操作复杂，工业化放大有一定难度。因此，需要开发一种低能耗、绿色环保的生物酶合成法。

发明内容

针对现有技术中的上述不足，本发明提供一种山梨糖还原酶OpCR基因、突变体及编码蛋白和在制备玻色因中的应用，本发明不但可以立体专一性地还原生成了玻色因，还避免了使用污染、危险的化学试剂，同时使得产品分离提纯简单高效。该方法能够高效地提高合成玻色因，具有见效快、成本低、操作简单、方便实施、产品无毒无残留等特征，以满足玻色因的大规模生产。

为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：

一种山梨糖还原酶OpCR基因，该OpCR基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步地，蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，OpCR基因的核苷酸序列为与SEQ ID NO.1所示序列具有70%以上同源性，且编码具有相同功能蛋白的序列。

进一步地，OpCR基因突变的核苷酸序列如SEQ ID NO.3~5所示，其编码的蛋白的氨基酸序列分别如SEQ ID NO.6~8所示。

进一步地，OpCR基因来源于保藏号为JCM 22074的 Ogataea parapolymorpha。（购自日本微生物保藏中心）

上述山梨糖还原酶OpCR基因，或蛋白在制备玻色因中的应用。

进一步地，包括以下步骤：

（1）将乙酰丙酮、木糖与催化剂在溶剂中混合加热反应，得到β-丙酮木糖苷；