[发明专利]一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法

说明书

本发明提供了一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法，包括以下步骤：(1)将pCAG‑floxP‑neo‑pH11载体通过单酶切得到线性载体，而后通过引物退火延伸得到hTERT片段，克隆到所述线性载体上；(2)将所述线性载体转化至感受态，进行菌落培养、PCR鉴定；(3)PCR鉴定正确的质粒进行测序鉴定，序列正确的hTERT重组质粒进行扩大培养，然后通过质粒纯化试剂盒纯化，从而构建永生化载体pCAG‑H11‑hTERT；(4)将pCAG‑H11‑hTERT及px459‑H11‑V2电转染至猪原代成纤维细胞；(5)用含有嘌呤培养基对细胞进行筛选，得到永生化成功细胞。本发明效率高、适应性强，永生化特性不易消失，适用于大多数难转染的细胞。

技术领域

本发明涉及细胞培养领域，尤其是涉及一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法。

背景技术

细胞永生化是当前细胞生物学研究热点之一，它是指细胞在病毒、辐射、药剂等作用下获得无限增殖的能力，可长期传代，并多伴有核型改变。永生化的关键是一种称为端粒酶(human telomerase re-verse transcriptase,hTERT)的酶，在体细胞的正常体外培养过程中，细胞的复制过程会被端粒的不断缩短而受限制，但当端粒酶被激活时，端粒的缩短被抑制从而使得细胞获得无限增殖的能力，因此通过构建含有hTERT的载体来转染细胞是常用的细胞永生化方法。

但脂质体转染法以及病毒介导的转染对于一些难转染细胞，转染效率非常低，并且耗时长，常规病毒介导的转染需要3到5天时间，此外以上两种方法介导的转染由于操作复杂所以转染稳定性常常难以保证，而电转染不受细胞类型的限制，可以转染几乎所有的真核细胞，包括病毒转染效率很低的原代细胞、干细胞等，并且转染效率非常高，在进行条件优化后重复性好，操作简单。

H11位点已经在小鼠中证实是安全区域，不受旁侧启动子影响，因此更合适用于表达外源基因，外源性的基因定点插入这个位点不会影响其他基因的表达。此外2015年Jin等人在大动物猪模型中同时利用CRISPR/Cas9系统成功且高效地在pH11位点插入目的基因片段，所以H11位点常用来构建基因敲入小鼠，将永生化基因插入H11位点即将能够将永生化基因整合进基因组，克服常规的永生化手段经过多次传代永生化特性会减弱或消失的缺点。

猪的组织结构和生理生化特性与人类相近，近些年来，基因编辑猪在动物育种、基因治疗等领域的研究越来越广泛，猪成纤维细胞是常用的体细胞核移植技术的供体细胞因此猪成纤维细胞的培养具有更深远的意义。但猪成纤维细胞作为原代细胞，在正常体外培养条件下虽然可以生长和分裂，但受分裂次数的限制，在有限次数内原代细胞就会走向衰老和死亡。

因此，建立一种高效、操作简单、有效的永生化猪成纤维细胞的方法具有重要科学意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法。本发明效率高、适应性强，永生化特性不易消失，适用于大多数难转染的细胞。

本发明的技术方案如下：

一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法，包括以下步骤：

(1)将pCAG-floxP-neo-pH11载体通过单酶切得到线性载体，而后通过引物退火延伸得到hTERT片段，克隆到所述线性载体上；

(2)将所述线性载体转化至感受态，进行菌落培养、PCR鉴定；

(3)PCR鉴定正确的质粒进行测序鉴定，序列正确的hTERT重组质粒进行扩大培养，然后通过质粒纯化试剂盒纯化，从而构建永生化载体pCAG-H11-hTERT；

(4)将pCAG-H11-hTERT及px459-H11-V2电转染至猪原代成纤维细胞；

(5)用含有嘌呤培养基对细胞进行筛选，得到永生化成功细胞。