[发明专利]一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法在审
| 申请号： | 202210263835.0 | 申请日： | 2022-03-17 |
| 公开（公告）号： | CN114574522A | 公开（公告）日： | 2022-06-03 |
| 发明（设计）人： | 庄乐南;赵语婷;贺津;张元;蒋思博 | 申请（专利权）人： | 浙江大学 |
| 主分类号： | C12N15/85 | 分类号： | C12N15/85;C12N15/90;C12N15/65;C12N15/54;C12N5/10;C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京挺立专利事务所(普通合伙) 11265 | 代理人： | 余莹 |
| 地址： | 310030 浙江*** | 国省代码： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 转染 永生 化猪成 纤维 细胞 方法 | ||
1.一种电转染永生化猪成纤维细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将pCAG-floxP-neo-pH11载体通过单酶切得到线性载体，而后通过引物退火延伸得到hTERT片段，克隆到所述线性载体上；
(2)将所述线性载体转化至感受态，进行菌落培养、PCR鉴定；
(3)PCR鉴定正确的质粒进行测序鉴定，序列正确的hTERT重组质粒进行扩大培养，然后通过质粒纯化试剂盒纯化，从而构建永生化载体pCAG-H11-hTERT；
(4)将pCAG-H11-hTERT及px459-H11-V2电转染至猪原代成纤维细胞；
(5)用含有嘌呤培养基对细胞进行筛选，得到永生化成功细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)所述单酶切采用Not I进行。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述感受态为E.coil DH5α；所述菌落培养基为含有氨苄抗生素的LB培养基，培养条件为36-40℃培养12-16h；所述PCR鉴定是将培养后的菌落的菌液碱裂解法提质粒进行。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述质粒纯化试剂盒为Endotoxin-Free的质粒纯化试剂盒。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述hTERT的正确序列如序列表所示。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(4)所述电转染中，两个质粒比例为1:1，共转染质粒6μg，细胞特异性核转染液和pmaxGFP阳性质粒比例41：9，共100ul，使用仪器为Lonza 4D-Nnclea opector，转染参数为DO-113。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(5)中，由于px459-H11-V2中携带嘌呤抗性，若成功插入可以整合到猪的基因组中，因此用含有嘌呤培养基对阳性细胞进行筛选，筛选浓度为3.5ug/mL；同时设置一盘未电转细胞作对照，对照细胞和电转细胞依据细胞密度进行换液或者传代，直至对照细胞全部死亡，则存活的电转细胞视为含有嘌呤抗性的细胞即永生化成功细胞。
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