[发明专利]一种基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A适配体试纸条的制备方法及应用

说明书

本发明公开一种基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A适配体试纸条的制备方法及应用，属于纳米生物检测领域。制备方法包括以下步骤：（1）PAMAM‑AuNPs偶联物的制备，（2）PAMAM‑AuNPs‑aptamer探针的制备，（3）结合垫的制备，（4）适配体互补链DNA1和DNA2与链霉亲和素复合物的制备，（5）T线和C线的制备，（6）试纸条的组装。本发明利用PAMAM树状大分子的末端具有多个活性基团，连接多个金纳米粒子，提高适配体试纸条的灵敏度，并通过Image J软件读取试纸条上显色带的光密度值，实现试纸条的半定量分析。

技术领域

本发明属于纳米生物检测技术领域，具体涉及一种基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A适配体试纸条的制备方法及应用。

背景技术

赭曲霉毒素A（Ochratoxin A，OTA）是一种由曲霉属和青霉属的某些产毒菌株产生的次级代谢产物，广泛存在于咖啡、啤酒、红酒、葡萄汁、玉米、小麦、蔬菜、肉类和肉制品中，具有很高的化学稳定性和热稳定性，在人体内易于吸收，但代谢非常缓慢，其半衰期超过30天。研究表明，它对人体和动物具有肾毒性、肝毒性、致畸、致癌和免疫抑制作用。为了更好地监控食品中的OTA含量，亟需建立快速、准确和灵敏地检测食品中OTA的方法。目前，检测OTA的仪器分析方法主要包括高效液相色谱法、液相色谱-质谱法、气相色谱-质谱法等。尽管这些方法灵敏度和准确性高，但检测时需要专业人员操作昂贵的大型仪器，而且制备样品的过程复杂。酶联免疫分析和免疫层析法不需要大型仪器，但是需要依赖抗体，抗体合成周期较长，价格高且抗体活性不稳定。

和抗体相比，适配体（aptamer）具有识别靶物质的范围广、特异性强、易修饰、稳定性好、可在常温下运输、易获得和成本低的优势，已广泛用于适配体侧流层析技术。据报道[1]，用于金标OTA适配体侧流层析试纸条的定性检出限可以达到1 ng/mL，半定量检出限低至0.18 ng/mL。但是，胶体金弱的光学性能，低的生物分子结合率，导致传统的金标侧流层析试纸的灵敏度较低，难以满足食品介质中痕量危害物的快速分析。PAMAM树状分子由烷基二胺和叔胺支链组成，具有高的结构柔韧性、亲水性、良好的生物相容性、高的机械稳定性和化学稳定性，并且在其分子末端具有大量的胺基，可固定多个纳米粒子，目前，尚没有关于PAMAM增敏的适配体侧流层析试纸条的研究。因此，本专利拟构建一种基于PAMAM增敏的金标适配体侧流层析试纸条。

发明内容

为了解决上述技术问题，本发明的目的在于提供一种基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A适配体试纸条的制备方法及应用。

为了实现上述目的，本发明提供以下技术方案：

一种基于PAMAM增敏的赭曲霉毒素A适配体试纸条的制备方法，所述制备方法如下所示：

（1）PAMAM-AuNPs偶联物的制备

量取浓缩后的AuNPs溶液，加入0.1 mol/L K₂CO₃溶液调pH至8.0-9.0，然后加入浓度为50μM的PAMAM溶液，室温下反应5 h，以12000 rpm离心20 min，再用超纯水重悬，4℃储存备用；

（2）PAMAM-AuNPs-aptamer探针的制备

将浓度为100 μM的适配体溶液加入到PAMAM-AuNPs偶联物中，加入80 mM的NaCl溶液至终浓度为50 mM，在室温下避光孵育48 h，以10000 rpm离心18 min后，加pH 8.0-9.0的PB缓冲溶液洗涤两次，加入偶联物复溶液重悬，最后在4℃条件下保存。

（3）结合垫的制备

将制备的PAMAM-AuNPs-aptamer探针通过划膜喷金仪喷于聚酯纤维素膜上，37℃烘干并于避光条件下储存备用；所述聚酯纤维素膜预先用结合垫处理液进行处理；

（4）适配体互补链DNA1和DNA2与链霉亲和素复合物的制备