[发明专利]一种薏苡仁中呕吐毒素酶联免疫检测试剂盒和方法

说明书

本发明涉及本发明涉及食品毒素残留检测技术，特别是一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒和方法。所述试剂盒包括96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体；所述96孔酶标板的反应孔中包被有式I所示的呕吐毒素衍生化半抗原；本发明建立了薏苡仁中呕吐毒素残留检测的酶联免疫检测法，灵敏度高、特异性好、操作简便、检测成低、一次性检测样本量大等特点，能够更好地满足我国食品企业、政府监管部门等开展检测工作。

技术领域

本发明涉及食品毒素残留检测技术，特别是一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒和方法。

背景技术

薏苡仁为药食两用常用大宗药材，具有利水渗湿、健脾止泻的功效。其原植物薏苡为禾本科植物，在生长过程中由于气候原因易受禾谷镰刀菌(F.graminearum)和黄色镰刀菌(F.cuLmorum)等产生呕吐毒素等多种真菌污染，产生呕吐毒素(vomitoxin)，又称脱氧雪腐镰刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，已被国际癌症研究机构(IARC)列为三类致癌物^[2]。

2020年版《中国药典》2351真菌毒素测定法中呕吐毒素以HPLC和LC-MS检测方法为主^[3]，该方法检测周期长，费时、费力，不能满足药材的快速大批量质量筛查。免疫分析技术是利用抗原、抗体的特异性反应建立的一种快速、灵敏检测方法，具有快速、简便、实时、易于进行现场检测、样品前处理简单、灵敏度高、选择性强、适合于高通量分析等优点。在医学、食品和环境等领域均有应用，其中以酶联免疫分析技术(enzyme-linkedimmunosorbent assay，ELISA)应用最为广泛^[4]。目前，甘草酸^[5]、青蒿素^[6]、人参皂苷Re^[7]、木犀草苷^[8]、绿原酸^[9](Zhang B等，2018)和葛根素^[10-11]等中药材指标性成分已建立相应的ELISA检测方法，而中药材中真菌毒素ELISA检测相关报道则较少。

目前，在食品等领域已有诸多呕吐毒素的ELISA检测方法报道^[12-13]，另外食品安全国家标准(GB 5009.111—2016)也已将呕吐毒素的ELISA检测方法进行了收载^[14]。前期实验研究结果发现，薏苡仁等基质复杂的中药材不能照搬采用食品行业国家标准中的前处理方法以及检测试剂，需针对中药材的复杂基质进行前处理和检测方法优化。

发明内容

基于上述领域的需求，本研究通过将呕吐毒素进行化学衍生，获得呕吐毒素-蛋白的完全抗原。利用单克隆抗体制备技术，制备呕吐毒素的单克隆抗体，通过对薏苡仁基质效应的综合考察，建立薏苡仁中呕吐毒素残留的酶联免疫检测方法，从而实现薏苡仁中呕吐毒素的快速批量检测。具体技术方案如下：

一种人工薏苡仁中呕吐毒素衍生化半抗原，其特征在于，具有式I所示的分子结构

其核磁共振氢谱参数如下：¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，6.54(d,1H,C＝CH)，4.26(d,1H,CH-O-)，4.06(s,1H,-CH-O)，3.58-3.65(s,3H,OH)，2.59-2.71(d,4H,-CH₂-)，1.46-1.71(m,2H,-CH-)，1.01(s,3H,-CH₃)。

一种人工薏苡仁中呕吐毒素人工抗原，是通过以下步骤制得：

合成权利要求1所述的呕吐毒素半抗原合成：将50mg呕吐毒素溶于乙腈中，加入200μL醋酸，搅拌，再加入40mg巯基丙酸，80℃搅拌12h；停止反应，加水，加氢氧化钠水溶液调pH到13，加乙酸乙酯萃取，除去有机相，加盐酸调节pH到6，加乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，石油醚洗涤结晶，得到所述的呕吐毒素衍生化半抗原；