[发明专利]一种薏苡仁中呕吐毒素酶联免疫检测试剂盒和方法

权利要求书

1.一种人工薏苡仁中呕吐毒素衍生化半抗原，其特征在于，具有式I所示的分子结构

其核磁共振氢谱参数如下：¹H-NMR(CDCl₃,300MHz)δ：11.0(s,1H,COOH)，6.54(d,1H,C＝CH)，4.26(d,1H,CH-O-)，4.06(s,1H,-CH-O)，3.58-3.65(s,3H,OH)，2.59-2.71(d,4H,-CH₂-)，1.46-1.71(m,2H,-CH-)，1.01(s,3H,-CH₃)。

2.一种人工薏苡仁中呕吐毒素人工抗原，是通过以下步骤制得：

合成权利要求1所述的呕吐毒素半抗原合成：将50mg呕吐毒素溶于乙腈中，加入200μL醋酸，搅拌，再加入40mg巯基丙酸，80℃搅拌12h；停止反应，加水，加氢氧化钠水溶液调pH到13，加乙酸乙酯萃取，除去有机相，加盐酸调节pH到6，加乙酸乙酯萃取，有机相蒸干，石油醚洗涤结晶，得到所述的呕吐毒素衍生化半抗原；

制备呕吐毒素人工抗原：将所述呕吐毒素衍生化半抗原分别与BSA和OVA偶联，作为免疫抗原(DON-BSA)和包被抗原(DON-OVA)。具体制备过程：取11mg呕吐毒素衍生化半抗原溶于1mL DMF中，取30mg DCC和30mg NHS溶于0.2mL水后加入半抗原溶液中，室温搅拌24h，得到溶液Ⅰ；称取50mg载体蛋白溶于3.8mL PBS中，得到溶液Ⅱ；将溶液Ⅰ逐滴缓慢滴加到溶液Ⅱ中，室温搅拌24h；用PBS于4℃透析3d，每天换3次透析液得呕吐毒素人工抗原。

3.一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含96孔酶标板，辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体；所述96孔酶标板的反应孔中包被有权利要求2所述的呕吐毒素人工抗原。

4.一种薏苡仁中呕吐毒素的酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包含辣根过氧化物酶标记的单克隆抗体，以及有权利要求1所述的呕吐毒素人工抗原。

5.根据权利要求3或4所述的试剂盒，其特征在于：还包含PBST洗涤液，封闭液。

6.一种检测薏苡仁中呕吐毒素的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)获取标准曲线：以标准品的0μg·kg^-1时的OD_450nm值为B₀值，其他质量浓度的OD_450nm值为B值，以标准品质量浓度的对数值为横坐标，百分吸光率值(B/B₀×100％)为纵坐标，用OriginPro7.5软件绘制标准曲线；

各质量浓度的标准品的OD_450nm测定步骤如下：用包被缓冲液将包被抗原稀释至最佳工作浓度后，包被于96孔酶标板上，100μL每孔，4℃下过夜；倾去板中溶液，用PBST洗涤1次，加入封闭液150μL每孔，37℃温育2h；去掉封闭液后，晾干；加入系列浓度的呕吐毒素标准溶液50μL/每孔，再加入经酶标抗体稀释液稀释至最佳工作浓度的酶标单克隆抗体溶液50μL每孔，25℃避光反应15min；洗涤4～5次后加入显色液100μL每孔，25℃显色5min，加入终止液50μL每孔，设定酶标仪于450nm处测定每孔吸光度值(OD值)；

(3)称取2.0g待测薏苡仁粉末样本溶于10mL去离子水中，震荡3min，4000r·min-1离心5min，取上清0.2mL溶于0.6mL去离子水中作为待测样品，代替上述测定步骤中的标准溶液采用上述测定步骤测得样品的OD450nm值，代入标准曲线得到待测薏苡仁粉末中呕吐毒素的质量浓度。