[发明专利]人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用

说明书

本发明公开的属于多态性检测技术领域，具体为人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用，包括同时检测PAI‑1 4G/5G、THBDc.‑151GT和PROC 565CT(rs146922325)和PROC c.574_576del基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、阳性质控A、阳性质控品B和阴性对照，所述试剂A包括PAI‑1 4G/5G野生型和THBD c.‑151GT野生型的特异性引物及普通探针和配对引物，PROC 565CT上下游引物、PROC 565CT野生型和突变型特异性探针，Taq DNA聚合酶、10xbuffer，dNTP和BSA，本发明使用PCR‑荧光探针法，扩增反应及检测采用完全封闭的系统，避免产生气溶胶污染导致的假阳性，操作方法简单，检测周期短，检测成本低，灵敏度和特异性好。

技术领域

本发明涉及多态性检测技术领域，具体为人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用。

背景技术

静脉血栓栓塞症是一种多因素疾病，遗传因素在VTE的发病中具有非常重要的作用，部分研究显示，不同遗传因素在VTE发病中的作用占比可能超过60％，超过50％的无诱因VTE患者可检测出不同类型的遗传因素导致的易栓倾向。

PAI-1蛋白是血浆中组织纤溶酶原激活物的主要抑制剂。PAI-14G/5G(rs1799762)位点基因突变与个体发生VTE的风险增加之间存在关联。PAI-1基因4G等位基因能够通过上调PAI-1基因表达从而引起血浆PAI-1浓度升高，患者处于高凝状态，表现为血栓倾向。

THBD编码血栓调节蛋白，是蛋白C抗凝系统的重要成员。血栓调节蛋白的抗凝功能主要体现在协助凝血酶激活蛋白C方面，当血液凝固时，血浆蛋白C处于无活性状态，需要局部高浓度的凝血酶切割激活肽来激活蛋白C成为活化的蛋白C，这一单纯的凝血酶激活过程通常很缓慢，而在辅因子血栓调节蛋白的协助下，凝血酶激活蛋白C的速率提高1000倍，高效的产生足够的活化的蛋白C，后者灭活激活的FV和FVIII，抑制血液继续凝固。当THBD发生突变时，会导致血栓调节蛋白的表达量减少，从而降低血栓调节蛋白对蛋白C的抗凝活性的激活。

PROC基因编码蛋白C，蛋白C可被TM激活形成活化的蛋白C进而产生抗凝效应。目前世界范围已有416个相关致病变异被发现。

目前静脉血栓风险基因多态性检测方法有很多种，包括直接测序法、芯片法、限制性片段长度多态性法、高分辨率溶解曲线法、扩增阻滞突变法(ARMS法)、Taqman荧光探针法。其中，测序法和芯片法虽然一次可对多基因多位点进行检测，但是操作繁琐，检测周期长，成本相对较高，不利于临床推广。限制性片段长度多肽法需要对扩增产物进行凝胶电泳，不仅操作繁琐，而且非封闭管理操作容易引起污染造成假阳性。高分辨率溶解曲线法虽然操作简便，但是特异性偏低，且对仪器设备要求较高。ARMS法和Taqman荧光探针法，操作简便，灵敏度高，但是对单碱基突变，尤其是高GC含量基因中的单碱基突变的特异性较差，会导致非特异扩增，可能产生假阳性结果。

为此，我们提出人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用。

发明内容

鉴于上述和/或现有人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明的目的是提供人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒及工艺和应用，能够解决上述提出现有的问题。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，本发明提供了如下技术方案：

人类静脉血栓风险基因多态性检测试剂盒，包括同时检测PAI-1 4G/5G、THBD c.-151GT和PROC 565CT(rs146922325)和PROC c.574_576del基因多态性的试剂盒，所述试剂盒包括试剂A、试剂B、阳性质控A、阳性质控品B和阴性对照；