[发明专利]检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒

说明书

本发明涉及检测技术领域，特别涉及检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒。本发明提供了引物探针组合，其具有包括如SEQ ID No.1～SEQ ID No.39中任意所述的核苷酸序列。本发明主要检测链球菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、肠球菌、白色念珠菌、铜绿假单胞菌、嗜麦芽窄食假单胞菌、大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、立克次体和巴尔通体共12种能引起感染性心内膜炎的病原体，单次能够检测4个检测通道和1个内控通道、对12种无关的人类常见病原体无非特异性扩增、能够进行绝对定量。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，特别涉及检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒。

背景技术

感染性心内膜炎(Infective endocarditis，IE)指因病原体直接侵犯心脏瓣膜而引起的一系列以瓣膜受累为特征的致命性疾病。活动期感染性心内膜炎(Activeinfective endocarditis，AIE)以血流动力学紊乱、难以控制的脓毒血症、瓣周脓肿、脑动脉瘤或脑出血、或大赘生物为主要临床表现。感染性心内膜炎患者早期症状缺乏特异性，首次就诊可出现在多个科室，临床通常采用传统或改良的Duke标准来诊断疑似IE的患者。近些年，IE的发病率呈明显增加趋势，尤其是老年人和住院患者中，风险因素主要包括细菌耐药、人工瓣膜置换术、植入器械术以及各种血管内检查治疗操作、年龄、血液透析、静脉注射毒品等。对于病原体诊断，血培养是公认的金标准，然而，血培养检测周期长、污染风险、采血量大、多菌复合检测能力差，且由于既往抗生素治疗、微生物量少、病原体生长缓慢等其他因素，约30％的IE患者的血培养假阴性，而且苛养微生物等非典型病原体无法培养，导致感染性心内膜炎的诊断和治疗存在滞后性、不科学性、滥用抗菌药物等问题。此外，由于抗生素治疗和污染，瓣膜培养结果存在争议。综上所述，IE由于临床症状不典型、心内结构破坏严重、血培养困难、病情进展迅速、病人院内死亡率高(15％～20％)等特点，往往在早期诊断和对症治疗上存在困难，亟需研发快速、灵敏的分子诊断方法对IE的多种病原体进行精准检测。

目前，不依赖培养的聚合酶链式反应(PCR)具有检测周期短、高灵敏高特异等优点，同时，定量PCR可用于监测治疗效果和预后评估，在诊断IE的病原体方面逐渐得到认可。主流的分子检测以荧光定量PCR为主，但随着技术的发展，新一代分子检测技术——数字PCR逐渐崭露头角。数字PCR(Digital PCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术，其核心是通过大规模单分子扩增实现拷贝数的直接绝对定量，直接获知目标核酸分子的数目，提高了检测灵敏度和准确度。数字PCR具有超高灵敏度、高特异性、绝对定量、高耐受性等优势，能够为IE提供早期、快速、准确、定量的病原菌诊断结果。

与本发明最接近的技术方案为荧光定量PCR技术，步骤：a.核酸提取；b.荧光定量PCR反应体系配制；c.扩增，收集荧光信号；d.标准曲线和CT值确定病原体拷贝数。

但荧光定量PCR技术的缺点主要有：

(1)荧光定量PCR的灵敏度低于数字PCR，可造成漏检，出现假阴性；

(2)荧光定量PCR通常只能做到两个荧光通道同时检测，无法兼顾内控通道；或者检测两份，即分别采用两个基因和一个内控基因构成检测体系；

(3)荧光定量PCR实现拷贝数的定量依赖于标准曲线，经已知浓度标准品推算未知浓度的样本，没有实现真正的绝对定量。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了检测感染性心内膜炎病原体的引物及数字PCR试剂盒，能单次能够检测4个检测通道和1个内控通道、对12种无关的人类常见病原体无非特异性扩增、能够进行绝对定量。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了引物探针组合，包括如下组合中的一种或两种以上：

组合X：