[发明专利]提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用

说明书

提高谷氨酸棒杆菌L‑苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用，涉及生物工程技术领域，由富马酸酶在马酸酶与苹果酸之间的结合位点上定点突变而成，所述富马酸酶突变体用于富马酸单向转化成苹果酸。本发明的一种提高L‑苹果酸产量的富马酸酶突变体，其与苹果酸底物的结合力弱，进而抑制富马酸酶催化苹果酸转化成富马酸，实现富马酸酶的单向催化富马酸转换成苹果酸，从而提高L‑苹果酸产量。

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用。

背景技术

L-苹果酸广泛应用于在食品、制药和其他工业。美国能源部(DOE)已经将苹果酸确定为可再生和大规模生产的十二种平台化学品之一。L-苹果酸的生产方法有化学合成法、酶固定化催化法和微生物发酵法，从环保和经济价值角度而言，通过构建基因工程菌发酵产苹果酸是最具发展潜力，也是各大企业角逐的热点。

谷氨酸棒状杆菌(C.glutamicum)是经典的食品安全微生物，用于多种有机酸的合成，如亮氨酸、赖氨酸等。富马酸酶(fumarase C，FumC)是谷氨酸棒杆菌的TCA循环中的一个关键酶，编码基因为fumC，该酶负责催化富马酸(又称延胡索酸)转变成L-苹果酸这一可逆水合反应。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法；主要研究分子间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。在分子对接技术的辅助下，选择合适的突变位点，通过基因工程改造富马酸酶，实现富马酸酶的单向催化，提高L-苹果酸产量，具有较好的可行性和研究价值。

发明内容

为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一种提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其与苹果酸底物的结合力弱，实现富马酸酶的单向催化，提高L-苹果酸产量。

本发明的目的之二在于提供一种提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体在生产L-苹果酸中的应用。

本发明的目的之三在于提供一种提高L-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，得到重组谷氨酸棒杆菌，用于催化富马酸生成L-苹果酸，可提高发酵法生产L-苹果酸的产量。

本发明的目的之一采用如下技术方案实现：

一种提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，由富马酸酶在马酸酶与苹果酸之间的结合位点上定点突变而成，所述富马酸酶突变体用于富马酸单向转化成苹果酸。

进一步地，富马酸酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸、第124位的组氨酸和第323位的脯氨酸进行单突变或多突变获得。

进一步地，所述富马酸酶突变体为下列之一：

(1)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第124位的组氨酸突变为天冬酰胺；

(2)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；

(3)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第323位的脯氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；

(4)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为天冬氨酸，且第323位的脯氨酸突变为天冬氨酸；

(5)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为谷氨酸，且第323位的脯氨酸突变为天冬氨酸。

进一步地，所述富马酸酶突变体包括以下任一种：

fumc-H124N突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

fumc-K320D突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；