[发明专利]提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体及构建方法和应用

权利要求书

1.一种提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其特征在于，由富马酸酶在马酸酶与苹果酸之间的结合位点上定点突变而成，所述富马酸酶突变体用于富马酸单向转化成苹果酸。

2.如权利要求1所述的提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其特征在于，富马酸酶突变体由氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸、第124位的组氨酸和第323位的脯氨酸进行单突变或多突变获得。

3.如权利要求2所述的提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其特征在于，所述富马酸酶突变体为下列之一：

(1)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第124位的组氨酸突变为天冬酰胺；

(2)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；

(3)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第323位的脯氨酸突变为天冬氨酸或谷氨酸；

(4)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为天冬氨酸，且第323位的脯氨酸突变为天冬氨酸；

(5)如SEQ ID NO:1所示的富马酸酶中第320位的赖氨酸突变为谷氨酸，且第323位的脯氨酸突变为天冬氨酸。

4.如权利要求1-3任一项所述的提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其特征在于，所述富马酸酶突变体包括以下任一种：

fumc-H124N突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；

fumc-K320D突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；

fumc-P323D突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示；

fumc-P323E突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；

fumc-K320E突变体，其核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示；

fumc-K320D-P323D突变体，其核酸序列如SEQ ID NO:8所示；

fumc-K320E-P323D突变体，其核酸序列如SEQ ID NO:9所示。

5.一种权利要求1-4任一项所述提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体在生产L-苹果酸中的应用。

6.一种提高L-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，包括权利要求1-4任一项所述提高谷氨酸棒杆菌L-苹果酸产量的富马酸酶突变体，其特征在于，包括如下步骤：

S1，以核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的fumc基因为模板，获得富马酸酶突变体的突变基因；

S2，将所述突变基因与pEC-xk99E表达载体连接，构建重组质粒；

S3，将所述重组质粒转到谷氨酸棒状杆菌内，得到重组谷氨酸棒状杆菌。

7.如权利要求6所述的提高L-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于：所述重组谷氨酸棒状杆菌通过发酵生产L-苹果酸。

8.如权利要求7所述的提高L-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，构建得到的重组谷氨酸棒状杆菌发酵生产L-苹果酸的方法，包括以下步骤：

1)将重组谷氨酸棒状杆菌接种至种子培养基中培养，得到种子液；

2)将所述种子液转送至发酵培养基中，发酵，收集产物得到L-苹果酸。

9.如权利要求8所述的提高L-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，步骤1)中，培养条件为：温度28-32℃，摇瓶的速率为150-200rpm，培养时间为16～24h；

步骤2)中，发酵条件为：温度28-32℃，发酵24h以内的摇瓶速率为180-220rpm，发酵24h以上的摇瓶速率为80-100rpm。

10.如权利要求8所述的提高L-苹果酸产量的重组谷氨酸棒杆菌的构建方法，其特征在于，步骤1)中，所述种子培养基包括以下组分：葡萄糖18-22g/L，蛋白胨14-18g/L，酵母粉8-12g/L，氯化钠3-7g/L；

步骤2)中，所述发酵培养基包括以下组分：(NH₄)₂SO₄ 18-22g/L、MOPES35-45g/L、尿素3-7g/L、KH₂PO₄ 0.8-1.2g/L、K₂HPO₄ 0.8-1.2g/L、Glucose 35-45g/L、生物素0.01-0.05mg/L、原儿茶酸0.01-0.05mg/L、MgSO₄·7H₂O0.1-0.4g/L、CuSO₄ 0.1-0.3mg/L、CaCl₂ 8-12mg/L、FeSO₄·7H₂O 8-12mg/L、ZnSO₄·7H₂O 0.5-1.5mg/L、MnSO₄·7H₂O 8-12mg/L、NiCl₂·6H₂O0.01-0.03mg/L。