[发明专利]一种检测菌体中活菌数和/或死菌数的方法

说明书

本发明涉及微生物发酵计数领域，特别是涉及一种检测菌体中活菌数和/或死菌数的方法。本发明通过将高密度发酵产生的菌体稀释至适宜数量级后用SYTO9和PI，并利用流式细胞仪对染色后的菌体进行计数，能够快速、准确地对高密度发酵液中乳酸菌活菌进行计数，与传统的平板计数法相比，不仅可以测得活菌数也可以测得死菌数量，具有高效率、高准确度和无差距的优点。

技术领域

本发明涉及微生物发酵计数领域，特别是涉及一种检测菌体中活菌数和/或死菌数的方法。

背景技术

高密度发酵(High Cell Density Culture，HCDC)技术是发酵工程的重要组成部分，制备高活性乳酸菌制剂的关键是要对乳酸菌进行高密度培养，该技术在改进乳酸菌发酵工艺的基础上，增加了单位体积发酵液中的菌体生物量，既提高了生产效率，又可以加速乳酸菌菌剂的商品化进程，意义重要而深远。传统观测高密度发酵终点的方法普遍运用的pH测量法、微生物平板计数法等方法，存在着高误差(平板计数过程中会出现两个甚至多个具有活性的副干酪乳杆菌由于距离较近成长成为一个菌落的情况，此时在平板计数过程中便将其判定为一个菌落，计数结果存在误差)、耗时长等缺点。因此，急需一种能够快速、准确地对高密度发酵液中乳酸菌活菌计数方法。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了一种检测菌体中活菌数和/或死菌数的方法。本发明提供的方法能够快速、准确地对高密度发酵液中乳酸菌活菌进行计数。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

本发明提供了一种检测菌体中活菌数和/或死菌数的方法，包括以下步骤：

将菌体稀释至菌体数量为10⁷cfu/mL数量级后，得到菌悬液；

将所述菌悬液进行荧光染色；所述荧光染色剂包括SYTO9染料和PI染料；

将荧光染色后的菌体与等体积的绝对计数微球混合，得到混合物；

检测混合物中的SYTO9染色菌数和PI染色菌数以及绝对计数微球数，根据式Ⅰ和/或式Ⅱ计算菌体中活菌数和/或死菌数；

活菌数＝(SYTO9染色阳性和PI染色阴性的菌数/绝对计数微球数)×绝对计数微球数浓度×稀释倍数，式Ⅰ；

死菌数＝(PI染色阳性和SYTO9染色阴性的菌数/绝对计数微球数)×绝对计数微球数浓度×稀释倍数，式Ⅱ。

优选的，所述SYTO9染料的使用浓度为0.5mmol/L，所述PI染料的使用浓度为0.1～0.15mg/mL；

所述SYTO9染料、PI染料和菌悬液的体积比为5:2:1000。

优选的，对所述菌悬液进行荧光染色的时间为15min。

优选的，所述检测混合物中的SYTO9染色菌数和PI染色菌数所使用的仪器包括流式细胞分析仪。

优选的，所述流式细胞分析仪包括MoFlo Astrios EQ超速流式细胞分析仪；所述流式细胞分析仪的设置参数包括：读取微粒总个数为500000个，SYTO绿光通道增益为200，PI红光通道增益为2000。

优选的，所述菌体的活菌数≥10⁶cfu/mL或10⁶cfu/g。

优选的，所述菌体包括乳酸菌。

优选的，所述乳酸菌包括乳杆菌。

优选的，所述乳杆菌包括副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和发酵乳杆菌。

有益效果：