[发明专利]大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用

说明书

本发明涉及大肠杆菌‑金葡菌生物传感器及其应用，该方案包括以下步骤：S00、选取有相同激发波长而发射波长不同的两种荧光素分子作为信号报告器件；S10、将羧基磁珠与含有大肠杆菌‑金葡菌的适配体序列进行偶联；S20、将带有荧光染料标签的大肠杆菌‑金葡菌适配体互补序列与相应适配体进行杂交并构建大肠杆菌‑金葡菌生物传感器。本发明具有操作简便、检测速度快及检测成本低的优点。

技术领域

本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用。

背景技术

当前，一次性卫生用品卫生标准主要依据国家强制性标准GB 15979，在该标准中，除了规定大肠杆菌、致病性化脓菌、真菌的检出限值外，还对大肠杆菌、金葡菌的杀灭率及抑菌率提出了具体指标要求。

因此，准确定量检测微生物的数量，尤其是大肠杆菌、金葡菌的数量显得极为重要。GB 15979规定采用平板培养法进行定量检测，耗时48h，检测时间长。对于大肠杆菌的检测，还需进一步通过乳糖胆盐产气发酵、伊红美蓝琼脂平板接种、革兰氏染色镜检结合乳糖发酵的手段来完成；而对于金葡菌的检测，则需通过SCDLP培养液增菌、血琼脂培养基培养、革兰氏染色镜检、甘露醇发酵试验、血浆凝固酶试验来完成。由于这两种微生物检测过程复杂、检测时间长，检测手段各不相同，对检测人员的专业素质提出了较高的要求，同时增加检测过程中受感染的风险。

因此，若能发展一种简便快速可靠的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，只需通过简单的加样就能实现大肠杆菌、金葡菌的同步检测，则能大大提高检测效率。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中存在的上述问题，提供了一种大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用了以下技术方案：大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法包括以下步骤：

S00、选取有相同激发波长而发射波长不同的两种荧光素分子作为信号报告器件；

S10、将羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联；

S20、将带有荧光染料标签的大肠杆菌-金葡菌适配体互补序列与相应适配体进行杂交并构建大肠杆菌-金葡菌生物传感器；

其中，采用包被核酸适配体的羟基磁珠作为大肠杆菌及金葡菌的特异性识别器件，将标记其中一种荧光染料的大肠杆菌适配体互补序列作为大肠杆菌的信号报告器件，将另一种标记荧光染料的金葡菌适配体互补序列作为金葡菌的信号报告器件。

进一步地，步骤S10中，将羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联的具体步骤为：

S11、通过偶联缓冲液清洗羧基磁珠多次，将羧基磁珠稀释至5mg/mL；

S12、用偶联缓冲液溶解EDC与Sulfo-NHS，按照1mg磁珠加入20-50μg的EDC和Sulfo-NHS的比例，在室温下对羧基磁珠进行活化15-45min直至活化结束；

S13、用偶联缓冲液洗去未反应的物质，然后将磁珠稀释至5mg/mL；

S14、用高压灭菌后的去离子水溶解大肠杆菌-金葡菌适配体至1μM，按照1mg磁珠加入1-10nmol的大肠杆菌-金葡菌适配体的比例，加入等物质的量的大肠杆菌-金葡菌适配体进行偶联反应，室温下反应直至反应结束；

S15、磁分离弃上清，加入封闭缓冲液封闭2-4小时，弃上清，再用封闭缓冲液重悬至羧基磁珠浓度为5mg/mL，备用。

进一步地，步骤S00中，采用Alexa Fluor 488荧光标记来标记大肠杆菌适配体互补序列，采用PE-CY5.5荧光标记来标记金葡菌适配体互补序列，该PE-CY5.5荧光标记通过标记PE-CY5.5的链霉亲和素与生物素化的金葡菌适配体互补序列定向偶联获得。