[发明专利]大肠杆菌-金葡菌生物传感器及其应用

权利要求书

1.大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S00、选取有相同激发波长而发射波长不同的两种荧光素分子作为信号报告器件；

S10、将羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联；

S20、将带有荧光染料标签的大肠杆菌-金葡菌适配体互补序列与相应适配体进行杂交并构建大肠杆菌-金葡菌生物传感器；

其中，采用包被核酸适配体的羟基磁珠作为大肠杆菌及金葡菌的特异性识别器件，将标记其中一种荧光染料的大肠杆菌适配体互补序列作为大肠杆菌的信号报告器件，将另一种标记荧光染料的金葡菌适配体互补序列作为金葡菌的信号报告器件。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，其特征在于，步骤S10中，将羧基磁珠与含有大肠杆菌-金葡菌的适配体序列进行偶联的具体步骤为：

S11、通过偶联缓冲液清洗羧基磁珠多次，将羧基磁珠稀释至5mg/mL；

S12、用偶联缓冲液溶解EDC与Sulfo-NHS，按照1mg磁珠加入20-50μg的EDC和Sulfo-NHS的比例，在室温下对羧基磁珠进行活化15-45min直至活化结束；

S13、用偶联缓冲液洗去未反应的物质，然后将磁珠稀释至5mg/mL；

S14、用高压灭菌后的去离子水溶解大肠杆菌-金葡菌适配体至1μM，按照1mg磁珠加入1-10nmol的大肠杆菌-金葡菌适配体的比例，加入等物质的量的大肠杆菌-金葡菌适配体进行偶联反应，室温下反应直至反应结束；

S15、磁分离弃上清，加入封闭缓冲液封闭2-4小时，弃上清，再用封闭缓冲液重悬至羧基磁珠浓度为5mg/mL，备用。

3.根据权利要求2所述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，其特征在于，步骤S00中，采用Alexa Fluor 488荧光标记来标记大肠杆菌适配体互补序列，采用PE-CY5.5荧光标记来标记金葡菌适配体互补序列，该PE-CY5.5荧光标记通过标记PE-CY5.5的链霉亲和素与生物素化的金葡菌适配体互补序列定向偶联获得。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，其特征在于，所述封闭缓冲液的制备方法为：称取6.06g的三羟甲基氨基甲烷、1g甘氨酸、1g牛血清白蛋白溶于1L的无菌水中，调节pH至7.0-7.4，过滤灭菌后待用。

5.根据权利要求3或4所述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，其特征在于，所述偶联缓冲液的制备方法为：称取9.76g的MES溶于1L的无菌水中，调节pH至4.5-5.5，高压灭菌后待用。

6.根据权利要求1-5任意一项所述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法，其特征在于，大肠杆菌适配体的5端经过氨基化修饰，具体序列为：

5’-NH₂-AAAAAATCCGTCACACCTGCTCTATCAAATGTGCAGATATCAAGACGATTTGTACAAGATGG-3’；

金葡菌适配体序列的5端经过氨基化修饰，具体序列为：

5’-NH₂-AAAAATCCCTACGGCGCTAACCTCCCAACCGCTCCACCCTGCCTCCGCCTCGCCACCGTGCTACAAC-3’。

7.大肠杆菌-金葡菌生物传感器，其特征在于，通过权利要求1-6任意一项所述的大肠杆菌-金葡菌生物传感器制备方法制备而得。