[发明专利]一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法

说明书

本发明公开了皮肤创伤修复技术领域的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，包括以下步骤：S1、脐带间充质干细胞上清液的收集；S2、胶原蛋白的提取；S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测；S4、胶原蛋白和MSC‑CM对角质形成细胞划痕愈合作用评估；S5、胶原蛋白和MSC‑CM对小鼠活体皮肤伤口愈合疗效评估，本发明将脐带间充质干细胞上清液和胶原蛋白相结合来治疗皮肤伤口愈合；解决了现有手段由于单独使用脐带间充质干细胞上清液，无法将其长时间的固定于机体损伤部位，导致治疗效率偏低的问题。

技术领域

本发明涉及皮肤创伤修复技术领域，具体为一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法。

背景技术

皮肤是动物机体最大的组织器官，约占机体表面积的70％，具有参与机体免疫反应，保护身体，排汗，感觉调节外界气温变化等功能。皮肤经常由于急性和慢性创伤而受损，这些创伤破坏了皮肤的屏障功能，严重者可导致患者死亡。皮肤创伤修复是一个非常复杂的过程，需要多种组织细胞的协调作用。目前临床上常用的治疗皮肤损伤修复的方法是常规清创缝合结合全身抗菌消炎治疗和自体皮肤移植结合抗菌消炎治疗。但是，目前的治疗方法存在治疗效率低、血管功能恢复差，容易形成疤痕等缺陷。

胶原蛋白是细胞外基质的重要组成部分，广泛存在于动物机体的皮肤、骨骼、肌腱以及软骨等处，是哺乳动物体内含量最多的蛋白质。胶原蛋白同时也是一种天然的生物材料，不仅具有独特的三螺旋结构、良好的生物相容性和可生物降解性，同时还具有低毒性、低免疫原性等优点，其在生物医用材料和高分子复合材料等方面的应用越来越备受关注。

间充质干细胞是一类具有自我更新和多向分化潜能的细胞，由于其来源广泛，免疫原性低，易于获得等优点，已经成为临床疾病细胞治疗的首选细胞，并且在皮肤损伤修复中具有良好的应用前景。间充质干细胞通过其旁分泌机制促进肉芽组织形成、调节炎症、增加皮肤细胞增殖和迁移，抑制细胞凋亡等来促进皮肤再生。在间充质干细胞培养过程中，其向培养液中分泌的外泌体具有促进机体损伤修复的能力，因此，近些年来间充质干细胞外泌体作为一种新型的无细胞疗法在皮肤损伤修复中的应用逐渐受到广泛的关注。

目前，间充质干细胞上清液在皮肤伤口愈合治疗中的用途有，将上清液注射于皮肤伤口周围的正常组织和直接外敷于皮肤伤口处，这两种方法均有一定的局限性，很难达到理想的效果；在伤口面积较大时，注射上清液无法实现整个伤口的全覆盖，而外敷由于间充质干细胞上清液呈液体状，流动性较强，其在创面停留的时间短，很难发挥有效的作用。

基于此，本发明设计了一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，以解决上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，通过将其与胶原蛋白结合制作混合剂，既可有效增加上清液在伤口处的停留时间，也可发挥上清液中外泌体对伤口愈合的促进作用。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，包括以下步骤：

S1、脐带间充质干细胞上清液的收集

首先准备2个10cm细胞培养皿，每个皿中按2x105个/mL的浓度，接种 6mL脐带间充质干细胞悬液，离心收集并培养上清液，将收集的上清液过滤后冷冻备用；

S2、胶原蛋白的提取

所用的胶原蛋白来源采用酸酶结合法提取得到；

S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测

首先，取一新的96孔板，将不同的胶原蛋白样品接种于孔中，并进行培育处理；将培养皿中的细胞消化后计数，制备12mL细胞悬液，吹打混匀后接种于96孔板中，每孔100uL，于37℃培养箱中孵育；