[发明专利]一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法

权利要求书

1.一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、脐带间充质干细胞上清液的收集

首先准备2个10cm细胞培养皿，每个皿中按2x105个/mL的浓度，接种6mL脐带间充质干细胞悬液，离心收集并培养上清液，将收集的上清液过滤后冷冻备用；

S2、胶原蛋白的提取

所用的胶原蛋白来源采用酸酶结合法提取得到；

S3、胶原蛋白对角质形成细胞细胞毒性作用检测

首先，取一新的96孔板，将不同的胶原蛋白样品接种于孔中，并进行培育处理；将培养皿中的细胞消化后计数，制备12mL细胞悬液，吹打混匀后接种于96孔板中，每孔100uL，于37℃培养箱中孵育；

然后，观察96孔板中每孔细胞汇合度达70％左右时，每孔加入10uL 5mg/mL MTT溶液，在细胞培养箱内继续孵育4h；每孔加入100uL Formazan溶解液，用100uL移液枪适当吹打混匀，在细胞培养箱内继续孵育30分钟至紫色结晶溶解；使用酶标仪测定各组特定点的吸光度值，并通过软件进行数据分析；

S4、胶原蛋白和MSC-CM对角质形成细胞划痕愈合作用评估

整个试验分为4个组，即低浓度血清培养基组、胶原蛋白+低浓度血清培养基组、MSC-CM组、胶原蛋白+MSC-CM组；

首先在6孔板中相应的试验孔中按2ug/cm2的量进行胶原铺板，在37℃培养箱放置2h后进行细胞接种，制备4mL细胞悬液，接种于6孔板中的4孔中，制作细胞划痕，加入MSC-CM及DMEM-F12培养基，并进行拍照，最后用image-j软件处理分析图片，即相应时间点的划痕面积，并计算划痕愈合率。

S5、胶原蛋白和MSC-CM对小鼠活体皮肤伤口愈合疗效评估

对胶原蛋白和脐带间充质干细胞上清液进行PH值中性调节，设置4个试验组，在小鼠背部制作全层皮肤伤口模型，在创口处敷实验组修复液，分别在治疗后第5d、10d、15d观察伤口愈合情况并拍照，图片继续使用image J软件分析处理。

2.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S1中，上清液收集获取的方式为：将接种的脐带间充质干细胞悬液24h后收集上清液于50mL离心管中，添加新的培养基，继续培养24h，期间细胞长满皿底消化传代后继续收集，连续收集7天。

3.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S1中，收集的上清液使用0.22um过滤器进行过滤，放于负20℃冰箱冻存。

4.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S2中，胶原蛋白从牛跟腱中提取得到，已经验证其完全符合I型胶原蛋白的相应特征。

5.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S2中，胶原蛋白样品的培育方式为：待胶原蛋白液平铺于孔底后将96孔板放于37℃培养箱中孵育1h，用PBS清洗96孔板中铺有胶原蛋白的孔。

6.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S3中，特定点为570nm处；最后将各组的吸光度值输入GraphPad prism软件中分析处理结果。

7.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S4中，在制备细胞悬液前将10cm细胞培养皿中的细胞消化后计数，制备的悬液通过吹打混匀后平均接种于6孔板中的4孔中，保温培育。

8.根据权利要求1所述的一种皮肤创伤修复液的制备及评估方法，其特征在于：在步骤S4中，制作细胞划痕前，待6孔板中每孔细胞汇合度接近100％时，于超净台中使用10uL枪头制作细胞划痕，每孔用PBS清洗2遍后，分别向相应的试验孔中加入含3％FBS的MSC-CM及DMEM-F12培养基；使用倒置显微镜对细胞划痕进行拍照后，将6孔板放于37℃培养箱中，并在一定的时间内拍照观察并保存照片。