[发明专利]一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器

说明书

本发明涉及生物医药检测技术领域，具体涉及一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒EVA71的检测系统，包括用于扩增EVA71的PV1基因的多交叉恒温扩增单元和检测单元；所述多交叉恒温扩增单元包括引物组合、链置换DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶缓冲液和MgSO₄等。检测单元为金纳米生物传感器，本方案采用多交叉恒温扩增结合金纳米生物传感器的方法。本方案不但有费用低廉和操作时间短的特点，而且它的检测灵敏度更高，无需昂贵的PCR产物检测仪器。本方案解决了现有的EVA71检测方法成本高、耗时长、操作复杂和检测灵敏度低等技术问题，将其应用在POCT等医学检测领域，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及生物医药检测技术领域，具体涉及一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒EVA71的检测系统。

背景技术

目前对于肠道病毒EVA71的检测的金标准主要依赖于传统的病毒培养和中和试验。该方法耗时大约5到7天，包括细胞培养，接种及后续的中和试验，其劣势是耗时耗力。随着核酸诊断技术的快速发展，以PCR为基础的诊断技术(如普通PCR技术，荧光PCR技术)被用于EVA71的检测，然而这些方法依赖于昂贵的仪器设备以及探针合成，需要后续的电泳操作，且对操作人员的熟练程度有较高的要求。以PCR为基础的诊断技术对于一些落后的实验室无法进行，限制了这些技术的运用。并且目前运用这些检测技术诊断肠道病毒EVA71的PCR方法和Real-time PCR方法，检测过程耗时较长，不利于快速检测和应急检测。

为了克服PCR扩增技术的劣势，近年来发展了许多恒温扩增技术。恒温扩增技术较PCR技术而言，不依赖于热循环扩增设备，反应速度快，敏感性好。因此，恒温扩增技术有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。到目前为止，已发展的恒温扩增技术有10余种，应用较为广泛的有滚环扩增(RCA)、连置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)、交叉扩增(CPA)等。然而，这些恒温技术实现核酸扩增需要多种酶同时工作，依赖于昂贵的试剂和复杂的操作步骤。因此这些方法的实用性，便捷性，可操作性有待于提高，尤其是在快速诊断领域及欠发达地区，上述恒温扩增技术难以实施。亟需研发一种适合于人类肠道病毒EVA71检测的基于恒温扩增系统的、可有效降低成本和提升检测便捷程度的快速检测技术。

发明内容

本发明的目的在于一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒EVA71的检测系统，用以解决现有的检测方法成本高、耗时长、操作复杂和检测灵敏度低等技术问题。

为解决上述技术问题，本发明技术方案如下：

一种基于多交叉恒温扩增和金纳米生物传感器的人类肠道病毒EVA71的检测系统，包括用于扩增EVA71的PV1基因的多交叉恒温扩增单元；所述多交叉恒温扩增单元包括引物组合；所述引物组合包括置换引物、交叉内引物和扩增引物；所述置换引物包括序列如SEQ ID NO:1所示的F1和序列如SEQ ID NO:2所示的F2；所述交叉内引物包括序列如SEQ IDNO:3所示的CP1和序列如SEQ ID NO:4所示的CP2；所述扩增引物包括序列如SEQ ID NO:5所示的C1和序列如SEQ ID NO:6所示的C2、序列如SEQ ID NO:7所示的D1和序列如SEQ ID NO:8所示的D2以及序列如SEQ ID NO:9所示的R1和序列如SEQ ID NO:10所示的R2。

采用上述技术方案，技术原理为：

本技术方案使用多交叉恒温扩增单元对待测样本中的EVA71的PV1基因进行扩增，扩大目的片段的拷贝数，便于进行后续的PV1基因的检测，进而诊断是否存在EVA71感染。本方案使用到了多交叉置换扩增(Multiple cross displacement amplification，MCDA)技术，能够在恒温条件下实现靶序列扩增。采用本方法对EVA71病毒的目的基因进行扩增，对设备的要求低且扩增效率高，具有扩增速度快、反应灵敏、特异性高等优点。这也是首次将该项技术应用在EVA71病毒的检测的实践操作中。