[发明专利]用于编码分泌型Mersacidin的基因表达盒及其制备方法

说明书

本发明属于基因工程领域，具体涉及用于编码分泌型Mersacidin的基因表达盒及其制备方法。本发明公开了一种用于编码分泌型Mersacidin的基因表达盒，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明利用高保真酶扩增Mersacidin基因簇基因mrsK2R2FGEAR1DMT的mrsK2R2FGE、mrsAR1D、和mrsMT，再利用Gibson克隆技术将Mersacidin基因簇3段基因连接，构建成Mersacidin表达盒，该表达盒置于强启动子的下游，将其导入基因工程菌Bacillus subtilisSCK168中实现Mersacidin的高效分泌表达，为饲料添加剂、兽药、食品及医药提供一种廉价的生物抗菌剂和防腐剂。

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及用于编码分泌型Mersacidin的基因表达盒及其制备方法。

技术背景

细菌素是细菌在代谢过程中通过核糖体合成的一类具有抑菌活性的多肽或前体多肽，有着理想的益生菌特性，其具备有效抑制病原体、调节炎症、促进伤口愈合和粘膜防御等功能，且不易产生耐药性的特点。

Mersacidin由Bacillus HIL Y-8554728产生，长20aa，属于Ib类细菌素。Mersacidin纯品为白色非晶粉末，在环境温度下稳定，pH 5.0～7.0稳定，不溶于水；金属盐易溶于水，且能增强其杀菌活性。Mersacidin通过与肽聚糖前体lipid II的糖磷酸基团形成复合物，抑制肽聚糖生物合成的转糖基化反应，从而抑制细胞壁合成杀灭微生物。Mersacidin对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的MIC为1～32μg/mL，对耐甲氧西林表皮葡萄球菌的MIC为0.5～16μg/mL，对链球菌的MIC为0.5～8μg/mL，对产气荚膜梭菌的MIC为0.5～8μg/mL。虽然mersacidin对MRSA的MIC大于万古霉素，但给MRSA(St.aureus E710)攻毒小鼠皮下注射25mg/kg Mersacidin进行治疗，治愈率达100％，而相同剂量万古霉素治疗组的存活率仅有67％。此外，Mersacidin经腹腔给药可以清除小鼠鼻炎模型中经鼻腔接种的MRSA菌株。以上证据证实，尽管Mersacidin体外MIC较高，但体内效果很好，具有开发成抗菌药物的潜力。

Mersacidin是由一个包括转录、翻译、运输和修饰等多个相关基因组成的基因簇AJ250862.2来合成的。该基因簇长12324bp，由10个ORF组成，由mrsA编码68个残基的前肽，前肽mrsA被mrsD脱羧和氧化，在C端半胱氨酸产生2-硫代乙胺功能。被修饰的mrsA作为mrsM产生四环结构的底物，经mrsT加工后分泌成为最终的生物活性化合物。其中有一个调控基因mrsR1，负责控制mrsA的合成；还有一个双组分系统mrsR2/mrsK2，编码参与诱导免疫基因mrsE、mrsF和mrsG的传感器和激酶。Bacillus amyloliquefaciens FZB42作为宿主菌外源表达Mersacidin已获得成功，但表达量较低。这说明外源表达Mersacidin是可行的，问题在于如何提高表达量，主要是如何提高表达菌株对Mersacidin的耐受性。

发明内容

为解决上述问题，本发明利用高保真酶扩增Mersacidin基因簇基因mrsK2R2FGEAR1DMT的mrsK2R2FGE、mrsAR1D、和mrsMT，再利用Gibson克隆技术将Mersacidin基因簇3段基因连接，构建成Mersacidin表达盒，该表达盒置于强启动子的下游，将其导入基因工程菌Bacillus subtilis SCK168中实现Mersacidin的高效分泌表达，为饲料添加剂、兽药、食品及医药提供一种廉价的生物抗菌剂和防腐剂。

本发明的目的之一，在于提供一种用于编码分泌型Mersacidin的基因表达盒。

为实现上述目的，本发明采取以下技术方案：