[发明专利]一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用，属于药物肽制备技术领域。本发明长效化艾塞那肽的制备过程包括：将艾塞那肽的序列融合构建到DARPin的N端，艾塞那肽与DARPin之间使用5个甘氨酸作为linker将艾塞那肽‑(Gly)₅‑DARPin使用微生物进行表达，收集微生物纯化即得长效化艾塞那肽。制得的长效化艾塞那肽能够在低剂量的情况下，长时间有效降低血糖浓度。

技术领域

本发明涉及药物肽制备技术领域，具体涉及一种长效化艾塞那肽的制备方法及其应用。

背景技术

艾塞那肽是一种胰高血糖素样肽-1(GLP-1)类似物，序列为：

His-Gly-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Leu-Ser-Lys-Gln-Met-Glu-Glu-Glu-Ala-Val-Arg-Leu-Phe-Ile-Glu-Trp-Leu-Lys-Asn-Gly-Gly-Pro-Ser-Ser-Gly-Ala-Pro-Pro-Pro-Ser-NH₂。

艾塞那肽主要用于治疗II型糖尿病。艾塞那肽具有GLP-1受体激动剂作用，在分子结构、生物活性、作用靶点及免疫原性等方面与GLP-1相似。艾塞那肽的分子结构与GLP-1的同源性达53％，结构差异表现在：C端多出9个氨基酸，不易被肽链内切酶降解；N端第二个氨基酸为甘氨酸，不会被二肽基肽酶IV(DPP-IV)分解。特殊的分子结构使艾塞那肽在血浆中的半衰期长达9.57小时，患者每天注射两次且低血糖发生风险小，当血糖升高时，艾塞那肽能够升高细胞内cAMP，诱导胰岛素释放；当血糖降低时，其诱导胰岛素释放的作用即会消退。然而，由于蛋白质/多肽类药物普遍存在体内半衰期较短，物理、化学稳定性较差，易被体内各种蛋白酶降解等特性，使得这些药物通常需要在一天之内多次注射，这给病人带来了许多痛苦和诸多不便。

现有技术中公布了很多制备艾塞那肽的方法以及延长艾塞那肽半衰期的方法，例如CN102532303A公开了使用甲氧基聚乙二醇残基与艾塞那肽分子中赖氨酸残基的氨基或N末端组氨酸残基的氨基缀合，合成聚乙二醇(PEG)缀合的艾塞那肽的方法；CN101980725A公开了脂肪酸-PEG-艾塞那肽的结构，并且PEG的修饰位点在N端His上。然而，使用PEG的缺点在于不能形成均一的产物；使用脂肪酸链修饰的链接的缺点在于工艺复杂，成本较高。需开发新的艾塞那肽衍生物，使其在体内作用时间长，稳定性好，降糖效果好，同时保持低毒性和较好的活性。

发明内容

本发明的目的在于提供一种半衰期长的长效化艾塞那肽的制备方法；本发明的另一个目的在于提供一种能够作为药物载体用于制备长效化艾塞那肽的DARPin蛋白。

为达到上述发明目的，采用如下技术方案：

一种长效化艾塞那肽的制备方法，包括如下步骤：

步骤1：设计长效化艾塞那肽序列，序列中包含DARPin序列；

步骤2：表达和纯化长效化艾塞那肽；

其中DARPin的序列如SEQIDNO.1所示。

DARPin作为药物载体，用于提高艾塞那肽在体内的半衰期，以提高艾塞那肽降血糖能力。

优选地，步骤1中长效化艾塞那肽的结构为6His-酶切位点-艾塞那肽-Linker-DARPin；

其中，6His为组氨酸纯化标签，其氨基酸序列为His-His-His-His-His-His；

Linker为连接肽，其氨基酸序列为：Gly-Gly-Gly-Gly-Gly；

艾塞那肽氨基酸序列为：