[发明专利]一种提高葡萄糖酸杆菌中2-KLG产量的两阶段发酵方法

说明书

本发明公开了一种提高葡萄糖酸杆菌中2‑KLG产量的两阶段发酵方法，属于生物工程技术领域。本发明结合葡萄糖酸杆菌最适生长条件与限速酶SDH适宜的催化条件，开发了两阶段发酵策略，本发明通过控制发酵过程的前48h pH为5.8～6.2、温度为28～32℃，第49‑168hpH为6.8～7.2、温度为33～35℃，使得2‑KLG产量相比于单阶段发酵提升了34.2％，达到52.2g/L。

技术领域

本发明涉及一种提高葡萄糖酸杆菌中2-KLG产量的两阶段发酵方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter)是一种好氧、杆状革兰氏阴性菌，因其卓越的糖醇不完全氧化能力，在维生素C、二羟基丙酮、米格列醇等诸多产品生产中发挥着重要作用。氧化葡萄糖酸杆菌能够高效的将山梨醇转化为山梨糖，是构建维生素C一步菌的理想底盘细胞。自然界中存在能够直接将山梨醇转化为维生素C前体，2-酮基-L-古龙酸(2-KLG)的葡萄糖酸杆菌，只不过这些野生菌的2-KLG产量都较低。在这些一步菌中，葡萄糖酸杆菌首先利用膜绑定的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖的山梨醇脱氢酶(SLDH)高效的将山梨醇转化为山梨糖，然后利用膜绑定的黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)依赖的山梨糖脱氢酶(SDH)将山梨糖转化为山梨酮，最后利用胞内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP⁺)依赖的山梨酮脱氢酶(SNDH)将山梨酮转化为2-KLG，其中SDH为整个反应中的限速酶。

经测定，葡萄糖酸杆菌最适生长条件为pH 6，30℃，而限速酶SDH的最优反应pH及温度分别为7和50℃。因此，考虑到葡萄糖酸杆菌最适生长条件与限速酶SDH最优催化条件的差异，本发明研究了两阶段发酵策略对葡萄糖酸杆菌生产2-KLG的影响。

发明内容

本发明结合葡萄糖酸杆菌最适生长条件与限速酶SDH适宜的催化条件，开发了两阶段发酵策略，提升了葡萄糖酸杆菌生产2-KLG的能力。

本发明提供了一株产2-KLG的重组葡萄糖酸杆菌，以蜡状葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter cerinus)CGMCC 1.110为出发菌株，过表达了山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶基因簇和山梨糖脱氢酶。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶基因簇来源于蜡状葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter cerinus)CGMCC 1.110。

在一种实施方式中，编码所述山梨糖脱氢酶的基因来源于蜡状葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter cerinus)CGMCC 1.110。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶基因簇以启动子P₁₁₄调控表达。

在一种实施方式中，所述山梨糖脱氢酶以启动子P₁₁₂调控表达。

在一种实施方式中，所述山梨酮脱氢酶-山梨糖脱氢酶基因簇的核苷酸序列如SEQID NO.2所示；编码所述山梨糖脱氢酶的基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；所述启动子P₁₁₄的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述启动子P₁₁₂的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明还提供一种提高葡萄糖酸杆菌一步菌中2-KLG产量的两阶段发酵策略；所述两阶段发酵策略为0-48h(发酵过程的前48h)维持pH 5.8～6.2、28～32℃，第49-168h维持pH 6.8～7.2、33～35℃。

在一种实施方式中，所述两阶段发酵是在0-48h维持pH 6、30℃，第49-168h维持pH7、33℃。

在一种实施方式中，所述两阶段发酵是0-48h维持pH 6、30℃，第49-168h维持pH7、35℃。

在一种实施方式中，发酵过程还控制转速为300～500rpm，通气量控制在1±0.05vvm。