[发明专利]肺泡灌洗液样本微生物宏基因组的提取及文库构建方法

权利要求书

1.一种基于肺泡灌洗液样本病原微生物宏基因组的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：

SA1:样本前处理：灌洗液样本经离心收集沉淀；若收集沉淀后样本粘稠，则液化样本，PBS缓冲液重悬样本；若收集沉淀后样本不粘稠时，直接PBS缓冲液重悬样本；

SA2:去宿主过程：在重悬的样本管内加入细胞裂解液200-500uL，震荡、离心弃净上清，加Super Nuclease核酸酶1-10uL，37℃孵育5-15min；再加入浓度为10-40mg/mL的Proteinase K 10-25uL，57℃孵育5-15min；

SA3:目的DNA的提取：将上述产物全部转移到含有氧化锆珠的研磨管，加入100-250uL细胞裂解液，20-50uL浓度为10-40mg/mL的Proteinase K和100-250uL结合缓冲液，恒温振荡仪70℃震荡孵育5-15min；

取产物加2-3倍无水乙醇漩涡震荡后转移至DNA吸附柱，离心后并添加500μL漂洗液I，10,000g离心1min；

添加500μL漂洗液II 17,000g离心3min，再全速空离1min；

将吸附柱放在干净的1.5mL微量离心管，添加50uL洗脱液；在室温下孵育5min，然后以10000g离心1min，收集管内样本DNA；

所述细胞裂解液中硫脲1-10mol/L、脲1-10mol/L、DTT 0.1-1mol/L、CHAPS1％-10％、Tris 0.01-0.08mol/L。

2.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于，步骤SA1中的液化试剂为二硫苏糖醇2.5g溶于31mL30％的CH₃OH。

3.根据权利要求1所述的提取方法，其特征在于：步骤SA3中的研磨管内有3颗大珠、5颗小珠。

4.一种肺泡灌洗液样本基因组的文库构建方法，其特征在于，构建方法包括如下步骤：抽提产物的DNA片段化、末端修复及A尾添加，接头连接，产物纯化、PCR富集、产物分选；具体步骤如下：

所述抽提产物的DNA采用权利要求1的提取方法得到；

SB1：抽提产物的DNA片段化、末端修复及A尾添加：在抽提产物的DNA中加入DKTPEnzyme Mix 5-15uL及DKTP Buffer 5-15uL，PCR仪37℃下反应10-30min，65℃下反应30min；

所述DKTP Enzyme Mix为酶组合物，其中：DNase I 1-10U/uL、Klwnow1-10U/uL、TaqDNA聚合酶0.1-0.5U/uL、T4多聚核苷酸激酶0.15-0.5U/uL；

SB2:接头连接：Ligase Mix 5-15uL，Rapid ligase Buffer10-30uL，PCR仪20℃下反应12-18min；

SB3:产物纯化：磁珠与灭菌超纯水提前室温放置，震荡混匀磁珠后吸取30-70uL磁珠到反应物中，移液枪混匀后室温放置3-5min，放置到磁力架，待溶液澄清后小心弃去上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入灭菌超纯水洗脱；SB4:PCR富集：向上述洗脱液中加入primer mix 5-10uL，PCR Amplification Mix 10-30uL，93℃预变性2min，96℃变性20s，60℃退火15-30s，72℃延伸30s，72℃后延伸7min；根据DNA投入量决定PCR循环数；

SB5:磁珠分选：向PCR下机产物中直接加入30-40uL磁珠，混匀后孵育3-5min，磁力架静置，转移上清至新管，加入10-30uL磁珠，混匀后孵育3-5min，转移至磁力架静置，弃上清，80％无水乙醇清洗两遍，晾干后加入灭菌超纯水洗脱，得到二代测序文库。