[发明专利]一种来源于南极细菌的磷脂酶D突变体及其应用

说明书

本发明公开了一种来源于南极细菌的磷脂酶D突变体及其应用，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:6或SEQ ID NO:8。本发明所构建的突变体S148C‑T206C和D225C‑A328C相比于野生型酶蛋白，在保持其最适反应温度条件不变的情况下，将其在最适反应温度条件下的半衰期提高到原来的1.4和2.0倍。S148C‑T206C和D225C‑A328C叠加突变后，其在最适反应温度条件下的半衰期提高到原来的3.2倍，且酶活力提高到原来的1.4倍。本发明获得的MsPLD突变体可适用于磷脂改性，生产磷脂酸及各类天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物，应用于生物、食品、医药、日化等领域。

技术领域

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体地说涉及利用分子生物学技术获得一种催化稳定性提高的磷脂酶D突变体及其大肠杆菌重组表达制备方法和应用。

背景技术

酶蛋白半衰期是评价酶性能和应用潜力的重要指标，筛选和改造获得温度稳定性较高的酶蛋白成为研究者所关注的焦点。通常，分子改造提高酶蛋白稳定性主要通过随机突变和基于结构进行理性设计两种方法来实现。随机突变因涉及到突变体建库，给后续筛选带来较大的工作量，且筛选效率较低。在酶蛋白结构中理性设计引入二硫键是被公认的可以提高酶蛋白稳定性的方法，但该方法需要了解酶蛋白结构信息，且对于二硫键引入位点的选择上需要综合考虑引入位点之间的空间距离、角度等因素。基于结构的理性设计手段已经被成功用于多种酶蛋白的改造以提高其热稳定性研究中，例如：ɑ-淀粉酶、纤维素酶、几丁质酶、脂肪酶、内切葡聚糖酶等。相比于随机突变，虽然大大节省了突变体构建筛选的时间和成本，但仍无法保证所预测设计的位点与预期结果相符。

磷脂酶D(PLD)作为一种重要的工具酶，被用于磷脂改性，在食品、医药和日化行业中具有极大的应用价值。在应用过程中，酶蛋白催化活力和催化反应稳定性是影响用酶成本的关键因素，开发高活力且高催化稳定性的磷脂酶D具有重要意义。现已报道磷脂酶D的酶活力都普遍较低，且以往对于该类酶的研究主要集中在酶蛋白底物选择性改造上，目前尚无基于二硫键的分子改造技术提升该类酶催化活性和稳定性的报道。

发明内容

本发明在前期对来源于南极细菌的PLD酶学性质及蛋白结构解析的基础上，尝试基于结构的酶蛋白二硫键引入策略来提升该酶在最适反应温度条件下的催化稳定性，以延长酶反应条件下的半衰期。通过借助分子动力学模拟和二硫键预测手段，在酶蛋白结构中理性设计引入了18个二硫键。在此基础上，开展实验验证，最终在筛选效果较好的两个突变体基础上，通过进一步叠加突变，进一步提升酶蛋白的温度稳定性，为该酶的下游应用奠定基础。

本发明的技术方案如下：

一种来源于南极细菌的磷脂酶D突变体，是在氨基酸序列为SEQ ID NO:1的亲本序列基础上突变亲本序列中第148和206、225和328相应位点突变为半胱氨酸，从而形成二硫键而获得，其氨基酸序列为SEQID NO:4或SEQID NO:6或SEQID NO:8。

一种编码上述磷脂酶D突变体的基因，其核苷酸序列为SEQID NO:3或SEQID NO:5或SEQID NO:7。

一种含上述基因的重组基因工程菌。

所述重组基因工程菌的制备方法：将所述磷脂酶D突变体的基因克隆到表达载体pET-21a、pET28a或pET32a上，转化大肠杆菌感受态细胞，获得重组基因工程菌。

所述磷脂酶D突变体可用于催化合成PA、PS等天然稀有磷脂和非天然磷脂化合物。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：