[发明专利]一种细胞代谢重编程的方法及其应用在审
申请号: | 202210160708.8 | 申请日: | 2022-02-22 |
公开(公告)号: | CN114426982A | 公开(公告)日: | 2022-05-03 |
发明(设计)人: | 陶飞;谭春林;许平 | 申请(专利权)人: | 上海交通大学 |
主分类号: | C12N15/74 | 分类号: | C12N15/74;C12N15/65;C40B50/06;C40B40/02;C12N1/21;C12N15/54;G16B35/20;G16B35/10;G16B25/20;G16B30/10;C12R1/63 |
代理公司: | 上海旭诚知识产权代理有限公司 31220 | 代理人: | 郑立 |
地址: | 200240 *** | 国省代码: | 上海;31 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 细胞 代谢 编程 方法 及其 应用 | ||
本发明公开了一种细胞代谢重编程的方法及其应用,属于基因工程领域,本发明利用细胞代谢网络的敏感节点对代谢网络进行重编程,主要包括基于CRISPRi的双基因组合敲弱、细胞高通量筛选和基于幸存率的基因交互作用分析三部分,本发明提供了一个新颖的、简单高效的、成本低廉的智能代谢重编程方法,可广泛用于操作细胞代谢网络。
技术领域
本发明涉及基因工程领域,具体涉及一种细胞智能代谢重编程的方法。
背景技术
工程生物学作为21世纪工程和科学的跨学科领域,对探索生命活动的基本规律和生物技术突破创新是有巨大帮助的。它使我们能够设计和构建新的生物分子组件、网络和途径来重新编程生物体。它的核心目标是应用工程生物技术来精确控制、调节和重塑微生物细胞工厂的代谢网络,以实现预期的产品的合成。
对细胞代谢网络的控制、调节和重塑也叫代谢重编程,它最早在癌症领域被广泛发现。在工程生物学或者合成生物学领域,代谢重编程是实现工程生物学目标的根本途径。因此,精准的进行细胞代谢的重编程,对于快速的构建细胞工厂是至关重要的。但是,目前要高效率的研究微生物代谢重编程是非常困难的。这首先是因为细胞中有几千个代谢产物和基因,它们交叉联结形成了一个高度复杂的具有混沌特性的代谢网络。另外代谢网络的操作理念和方法都十分匮乏,缺少有效且简单低廉的操作工具,而且也缺少相应的理论帮助人们选择进行代谢网络操作的切入点。因此,使用传统的方法进行细胞的重编程,基本上只能用穷举试错的方式,要获得目标产物的高产,就需要耗费大量的时间、人力、物力和成本。
不同的环境信号,如光、温度、pH、压力等因素能够刺激生物细胞进而启动细胞的天然代谢重编程。这中自然的代谢重编程是细胞通过表面的信号传感器来感知信号然后诱发细胞内的代谢网络发生变化,以此来响应不同的生理信号的刺激。这种在进化过程中形成的细胞感知环境的传感器及其相关的通路对于细胞在复杂多变的环境中的生存是关键性的,可以认为这些传感器所控制的是细胞代谢网络的敏感节点。因此,本发明提出利用这些自然的信号传感器的组合干预来实现细胞代谢重编程的方法。如图1所示,这种方法能够直接对细胞代谢网络的敏感节点进行组合操作,除了敏感节点,该方法也可以做全基因组水平上的任何节点的操作,并具备高效率的特点,可以认为是一种智能型的代谢重编程。
目前,从全局层面对多个基因的相互作用研究的方法极少,且成本很高。因此,开发一种实现简单、价格低廉且操作高效的方法来进行生物的智能代谢重编程是非常有意义和价值的。
发明内容
有鉴于现有技术的上述缺陷,本发明的目的是提供一种细胞代谢重编程的方法。
本发明基本原理是构建了一个基于CRISPRi的双基因敲弱文库和基于生物传感器的高通量筛选方法,偶联一个基于幸存率的基因交互分析平台,并选择在下一代工业底盘快速生长的弧菌FA2作为表达菌株。
本发明的第一个方面是提供一种细胞代谢重编程的方法,主要包括以下步骤:
S1、构建基于CRISPRi的双sgRNA敲弱的菌株文库;
S2、进行细胞高通量筛选;
S3、基于幸存率的基因交互作用分析。
进一步地,所述S1包括以下步骤:
S1.1、构建工具质粒:
将两个sgRNA表达框构建到pE1A质粒上,并在所述两个表达框中间插入毒性蛋白ccdB和Golden Gate的酶切位点;
所述工具质粒可以用来与文库的片段进行Golden Gate连接,实现不同基因靶向的双sgRNA质粒文库的构建。
S1.2、构建双sgRNA文库的重组片段:
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