[发明专利]一种细胞代谢重编程的方法及其应用

权利要求书

1.一种细胞代谢重编程的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、构建基于CRISPRi的双sgRNA敲弱的菌株文库；

S2、进行细胞高通量筛选；

S3、基于幸存率的基因交互作用分析。

2.如权利要求1所述的细胞代谢重编程的方法，其特征在于，所述S1包括以下步骤：

S1.1、构建工具质粒：

将两个sgRNA表达框构建到pE1A质粒上，并在所述两个表达框中间插入毒性蛋白ccdB和Golden Gate的酶切位点；

S1.2、构建双sgRNA文库的重组片段：

合成目标文库的n对引物，以S1.1获得的工具质粒为模板，通过PCR扩增双sgRNA文库片段，纯化后，通过Golden Gate方法酶切酶连，将所述文库片段连接到S1.1获得的工具质粒上，获得双sgRNA文库的重组体系；

S1.3、构建双sgRNA文库的质粒：

将所述双sgRNA文库的重组体系转化到大肠杆菌E.coli K12中，涂布到有筛选抗性的固体平板上，采用液体培养基洗脱，获得双sgRNA文库质粒菌株，将所述菌株作为种子液，在含有筛选抗性的培养基中扩培后，再提取质粒，获得双sgRNA文库的质粒；

S1.4、构建基于CRISPRi的双sgRNA敲弱文库菌株：

将S1.2得到的双sgRNA文库质粒转化到含有dCas9表达模块的pS8K质粒的菌株中，获得基于CRISPRi的双sgRNA敲弱文库菌株，并进行活性验证。

3.如权利要求2所述的细胞代谢重编程的方法，其特征在于，S1.2中所述n对引物序列中N20部分的序列按照不同的建库基因来进行设计。

4.如权利要求2所述的细胞代谢重编程的方法，其特征在于，S1.4中所述菌株为弧菌FA2。

5.如权利要求1所述的细胞代谢重编程的方法，其特征在于，S2中所述高通量筛选包括以下步骤：

将所述双sgRNA敲弱文库菌株的目标产物对应的生物传感器和下游报告基因egfp偶联，构建到含有dCas9表达模块的pS8K质粒中，并转化到S1.4所获得的菌株中，通过流式细胞分选技术进行细胞分选。

6.如权利要求5所述的细胞代谢重编程的方法，其特征在于，所述生物传感器选自核糖体开关、调控蛋白或转录调控因子任一种。

7.如权利要求1所述的细胞代谢重编程的方法，其特征在于，所述S3包括以下步骤：

提取S2获得的荧光值相比对照组高的细胞质粒，通过PCR扩增出多样性片段送二代测序，利用分析程序包进行基于幸存率的基因交互分析，所述利用分析程序包进行交互分析包括以下步骤：

S3.1建立目标基因的NiNj序列库；

S3.2利用Python3程序提取测得序列的双N20区域的序列；

S3.3利用Bowtie2算法将测得的序列与已经建立的双N20序列库进行比较；

S3.4比较得到的结果具体展现为Excel表格和热图。

8.如权利要求1～8任一项所述的细胞代谢重编程的方法在生物制造或代谢重编程中的应用。

9.一种由权利要求1-8任一项所述的方法构建的敲弱文库菌株，其特征在于：包括基于CRISPRi的双sgRNA文库质粒和进行高通量筛选的生物传感器。

10.如权利要求9所述的敲弱文库菌株，其特征在于：所述菌株为弧菌FA2。