[发明专利]一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒，试剂盒包含所述引物组，所述引物组由正向引物F、反向引物R和荧光探针Q组成，试剂盒还包括DNA聚合酶，UDG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照品、阴性对照品。本发明提供的试剂盒可直接从复杂样品中检测欧洲鳗鲡圆环病毒，具有特异性强、灵敏度高、实验重复性好、操作便捷快速的优点，不需要昂贵仪器即可完成检测，可用于欧洲鳗鲡圆环病毒的现场快速、准确检测。

技术领域

本发明涉及一种病毒检测技术领域，尤其涉及欧洲鳗鲡圆环病毒检测技术。

背景技术

欧洲鳗鲡圆环病毒是圆环病毒科圆环病毒属成员，是引起鳗鲡病毒性疾病的病原之一。目前国外已经在海龟、鳗鲡、鲃鱼、鲶鱼等水生动物检测出圆环病毒的报道，国内关于鳗鲡病毒性疾病的研究较少，有研究者从160份急性大量死亡的疑似鳗鲡病毒性疾病病料检测出高达40.6％鳗鲡圆环病毒阳性率，这表明鳗鲡圆环病毒可能会严重危害鳗鲡养殖产业的发展。

目前对欧洲鳗鲡圆环病毒的生物学检测技术也仅基于传统PCR检测技术，其检测过程操作步骤多，耗时长，且过程易造成气溶胶污染。实时荧光定量PCR(QuantitativeReal－time PCR)是在常规PCR技术的基础上添加荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，通过标准曲线对未知浓度模板进行定量分析的方法。与普通PCR技术相比，实时荧光定量PCR技术的TaqMan探针特异性强，可进行单个核苷酸的区分，同时操作更简便，检测时间更短。为欧洲鳗鲡圆环病毒的分子生物学诊断提供了一种快速、准确的检测手段。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组及试剂盒，以解决现有技术中缺乏欧洲鳗鲡圆环病毒的分子生物学诊断的基础。

为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：

一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR引物组，所述引物组由正向引物F、反向引物R和荧光探针Q组成，所述正向引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，荧光探针Q的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。

进一步地，所述荧光探针Q的5’端标记荧光基团，3’端标记淬灭基团。

本发明还提供一种用于检测欧洲鳗鲡圆环病毒的荧光定量PCR试剂盒，其包含权利要求1所述的引物组。

更优地，试剂盒还包括DNA聚合酶，UDG酶，2×反应缓冲液，密封液，阳性对照品，阴性对照品。

更优地，所述2×反应缓冲液是含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP的反应液。

更优地，所述DNA聚合酶为Taq酶，UDG酶为热敏型尿嘧啶-DNA糖基化酶，密封液为矿物油。

更优地，所述阳性对照品为含有欧洲鳗鲡圆环病毒检测靶标基因的质粒DNA，所述阴性对照为灭菌超纯水。

更优地，其反应体系成分组成为：终浓度为0.2～0.6μM的正向引物F，终浓度为0.2～0.6μM的反向引物R，终浓度为0.1～0.3μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶2～5U，UDG酶0.3～0.7U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL。

更优地，其反应体系成分组成为：终浓度为0.4μM的正向引物F，终浓度为0.4μM的反向引物R，终浓度为0.2μM的荧光探针Q引物，2×反应缓冲液12.5μL，DNA聚合酶4U，UDG酶0.5U，待检样品5μL，加灭菌超纯水至25μL。

更优地，其反应体系的反应条件为50℃5min；95℃5min；95℃15s、60℃30s 45个循环。

本发明的优点包括：