[发明专利]一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法和催化应用

说明书

本发明公开了一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法和催化应用，选取一种出发质粒，在质粒的酶切位点连接单加氧酶基因HpaBC，获得环形质粒pHG04，以获得的环形质粒pHG04为模板，在其酶切位点连接脱氢酶基因FDH，获得环形重组质粒pHG05，再以大肠杆菌代谢菌为出发菌株，通过化学转化法导入环形重组质粒pHG05，获得构建重组菌株sHG05；以构建重组菌株sHG05作为生物酶，经过细胞培养并诱导，再催化4‑香豆酸制备咖啡酸，并检测咖啡酸的产量。本发明以大肠杆菌代谢菌为出发菌株，通过化学转化法导入重组质粒pHG05，获得一种新的生产咖啡酸的菌株，可作为生物酶催化4‑香豆酸制备咖啡酸，能够为反应过程提供了充足的胞内辅酶，降低底物残留，提高咖啡酸产量。

技术领域

本发明涉及一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法和催化应用，属于代谢工程技术领域。

背景技术

咖啡酸广泛分布于茵陈、菜蓟、金银花等多种中药植物中，属于酚酸类化合物，具有心血管保护、抗诱变抗癌、抗菌抗病毒、降脂降糖、抗白血病、免疫调节、利胆止血及抗氧化等药理作用。最初，从植物中提取咖啡酸，但含量较低，耗费大量植物，且占用面积较大，植物培养也受天气影响较大；随着工业的发展，后来采用化学法合成咖啡酸，但由于咖啡酸在结构上存在顺式和反式的差别，且存在底物残留，产量较低，完全分离出单一纯品咖啡酸较为困难。鉴于此，本发明提供一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法和催化应用。

发明内容

针对上述现有技术存在的问题，本发明提供一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，以大肠杆菌代谢菌为出发菌株，通过化学转化法导入重组质粒pHG05，获得一种新的生产咖啡酸的菌株，以该菌株作为生物酶用于催化4-香豆酸制备咖啡酸，能够为反应过程提供了充足的胞内辅酶，降低底物残留，提高咖啡酸产量。

为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明提供了一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，具体制备步骤如下：

S1、构建质粒pHG04：以质粒为模板，通过聚合酶链式反应进行基因扩增，后经DpnI（甲基化模板消化酶）消化后得到线性化载体，并标记为线性化载体1，全基因合成单加氧酶基因HpaBC，记作为基因片段1，在线性化载体1的酶切位点通过连接试剂盒连接基因片段1，获得环形质粒，标记为pHG04；

S2、构建重组质粒pHG05：以步骤S1中构建的环形质粒pHG04为模板，通过聚合酶链式反应进行基因扩增，后经DpnI消化后得到线性化载体，并标记为线性化载体2，全基因合成脱氢酶基因FDH，并标记为基因片段2，将线性化载体2的酶切位点通过连接试剂盒连接基因片段2，获得重组环形质粒，标记为pHG05；

S3、构建重组菌株sHG05：取1μl步骤S2中构建的环形重组质粒pHG05加入至100μlBL21（DE3）感受态细胞，冰浴30min后，置于水浴中热敷进行热休克处理，后立即冰浴2min，再加入1ml的LB液体培养基，置于37℃培养1h，使菌体复苏，最后将含环形重组质粒pHG05的细胞均匀涂布在琼脂糖培养皿上，挑取单菌落，得到重组菌株，标记为sHG05；

S4、菌体保藏：向步骤S3中构建的重组菌株sHG05中加入甘油，使重组菌株sHG05的最终浓度为15~40%，置于-80℃冰箱中进行保藏。

其中，步骤S1中的质粒为质粒pADuet、质粒pCDuet、质粒pEDuet或质粒pRDuet的一种，所述质粒pADuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述质粒pCDuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述质粒pEDuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述质粒pRDuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

其中，步骤S1中的单加氧酶基因HpaBC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.8所示的任一序列。

其中，步骤S2中的脱氢酶基因FDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.11所示的任一序列。