[发明专利]一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法和催化应用

权利要求书

1.一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，其特征在于，具体制备步骤如下：

S1、构建质粒pHG04

以质粒为模板，通过聚合酶链式反应进行基因扩增，后经DpnI（甲基化模板消化酶）消化后得到线性化载体，并标记为线性化载体1，全基因合成单加氧酶基因HpaBC，记作为基因片段1，在线性化载体1的酶切位点通过连接试剂盒连接基因片段1，获得环形质粒，标记为pHG04；

S2、构建重组质粒pHG05

以步骤S1中构建的环形质粒pHG04为模板，通过聚合酶链式反应进行基因扩增，后经DpnI消化后得到线性化载体，并标记为线性化载体2，全基因合成脱氢酶基因FDH，并标记为基因片段2，将线性化载体2的酶切位点通过连接试剂盒连接基因片段2，获得重组环形质粒，标记为pHG05；

S3、构建重组菌株sHG05

取1μl步骤S2中构建的环形重组质粒pHG05加入至100μl BL21（DE3）感受态细胞，冰浴30min后，置于水浴中热敷进行热休克处理，后立即冰浴2min，再加入1ml的LB液体培养基，置于37℃培养1h，使菌体复苏，最后将含环形重组质粒pHG05的细胞均匀涂布在琼脂糖培养皿上，挑取单菌落，得到重组菌株，标记为sHG05；LB液体培养基的配方：每升培养基中，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余为水，pH控制为5.5~6.5；

S4、菌体保藏

向步骤S3中构建的重组菌株sHG05中加入甘油，使重组菌株sHG05的最终浓度为15~40%，置于-80℃冰箱中进行保藏。

2.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，其特征在于，步骤S3中的水浴温度为42℃，热敷时间为60s。

3.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，其特征在于，步骤S1中的质粒为质粒pADuet、质粒pCDuet、质粒pEDuet或质粒pRDuet的一种；其中，所述质粒pADuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述质粒pCDuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述质粒pEDuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述质粒pRDuet的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

4.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，其特征在于，步骤S1中的单加氧酶基因HpaBC的核苷酸序列如SEQ ID NO.5~SEQ ID NO.8所示的任一序列。

5.根据权利要求1所述的一种提高咖啡酸产量的菌株的制备方法，其特征在于，步骤S2中的脱氢酶基因FDH的核苷酸序列如SEQ ID NO.9~SEQ ID NO.11所示的任一序列。

6.一种用权利要求1制备的菌株制备咖啡酸的催化方法，其特征在于，具体催化步骤如下：

S.s1、发酵培养

取上述甘油保藏的重组菌株sHG05，按照体积比为1%的接种量活化于LB液体培养基中，后于37℃进行过夜培养，将过夜培养的重组菌株sHG05按照体积比为1%的接种量转接到50ml TB发酵培养基中；LB液体培养基的配方：每升培养基中，胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，其余为水，pH控制为5.5~6.5；TB发酵培养基的配方：每升培养基中，胰蛋白胨12g，酵母提取物24g，甘油4ml，其余为水，pH控制为5.5~6.5；

S.s2、诱导表达

当细胞OD600达到0.2~1.2后，加入IPTG，并使IPTG的最终浓度为0.1~0.3mM，在20~40℃进行诱导表达12~24h；

S.s3、生物转化

诱导表达结束后，在温度为4℃、转速为2000-8000 rpm的条件下离心3~15min，取细胞沉淀，置于10ml磷酸缓冲液中，加入4-香豆酸、甲酸铵，然后进行生物催化反应，后采用高效液相色谱对咖啡酸的含量进行测量。

7.根据权利要求6所述的一种制备咖啡酸的催化方法，其特征在于，步骤S.s3中的细胞生物量为8~18g/m³，4-香豆酸的浓度为1~10g/L，甲酸铵的浓度为1~5g/L。