[发明专利]猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用

说明书

本发明公开了猪视网膜上皮细胞系(WWX04‑PR)及其建立方法和应用，该细胞系于2020年7月27日，本发明猪视网膜上皮细胞易于培养，生长速度较快，能稳定传代，细胞活率高、纯度高且能很好保藏；通过无菌获取猪眼球组织分离获得高活力的原代猪视网膜细胞，然后导入含有猪腺病毒E1基因的真核表达质粒pCI‑neo‑E1，筛选和扩大培养，获得一株可稳定传代猪视网膜上皮细胞系；得到的细胞系能够用于生产猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒等疫苗抗原，还可用于临床野毒分离鉴定。该细胞系可作为人类视网膜相关疾病研究的细胞模型，也是研究中枢神经系统发育和功能的经典模型。

技术领域

本发明涉及动物细胞工程领域，具体涉及猪视网膜上皮细胞系，还涉及猪视网膜上皮细胞系(WWX04-PR)的建立方法和应用。

背景技术

猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)是迄今发现的一种最小的动物病毒。它是断奶仔猪多系统衰竭综合征的主要病原，猪皮炎与肾病综合征、增生性坏死性肺炎、猪呼吸道疾病综合征、繁殖障碍、先天性颤抖、肠炎等疾病亦与PCV2感染有重要关联，给养猪业造成严重的经济损失。现已被世界各国的兽医与养猪业者公认为是继猪繁殖与呼吸综合征(PRRS) 之后新发现的引起猪免疫障碍的最重要传染病。然而PCV2在多数细胞上没有细胞病变，对于PCV2的分离鉴定、致病机理研究以及疫苗研制均有较大的影响，也进一步阻碍了PCV2 的防治和疫病蔓延。前期研究发现PCV2可在猪视网膜细胞中高效增殖且能产生明显的细胞病变，是良好的病毒增殖载体和疫苗研制的素材，而原代细胞不但生产成本高，且操作繁琐，不利于生产应用。因此迫切需要建立猪视网膜上皮细胞系。

猪是解决各种免疫学问题的宝贵大型动物模型，猪视网膜上皮细胞系的建立，有利于各种免疫学和致病机理的研究，也可以作为药物残留检测工具，也可以开展基因表达规律和生物形状特征的研究。同时，猪和人类视网膜具有相似的结构和特征，猪神经视网膜的离体培养为研究人类视网膜损伤和退行性疾病的机制提供了一个有吸引力的模型。可用于建立和表征成年猪视网膜培养系统作为实时视网膜存活的快速筛查工具的方法。猪视网膜是研究中枢神经系统发育和功能的经典模型。

因此，现在急需对其方法进行改进，使猪视网膜细胞能够稳定传代下去，达到高细胞活率、高纯度的标准且能得到很好的保藏并延续下去。

发明内容

针对上述现有技术中存在的问题，本发明的目的之一在于提供一种易于培养、操作方法简便的猪视网膜上皮细胞系；本发明的目的之二在于提供猪视网膜上皮细胞系的应用；本发明的目的之三在于提供猪视网膜上皮细胞系的建立方法。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、猪视网膜上皮细胞系，所述猪视网膜上皮细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020112，保藏日为2020年6月18日。

2、上述猪视网膜上皮细胞系可用于猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、猪流行性腹泻病毒等病毒的分离以及鉴定，并为相关猪圆环病、猪伪狂犬病、流行性腹泻病等相关疫苗抗原制备提供体外培养载体，还可用于病毒如猪圆环病毒、猪伪狂犬病毒、流行性腹泻病毒在猪视网膜上皮细胞增殖特性、复制感染及致病机理等方面的研究；还可以作为解决各种免疫学问题的动物模型，也可以作为药物残留检测工具，甚至可以作为人中枢神经系统发育和功能的经典模型。

3、所述猪视网膜上皮细胞系的建立方法，具体包括如下步骤：

(1)原代培养：采集初生仔猪的眼球组织，无菌分离出猪视网膜组织，采用组织块法分离，置于37℃，5％CO₂条件下培养约7天，获得高活力的原代猪视网膜细胞；

(2)真核表达质粒pCI-neo-E1的构建

1)pCI-neo质粒的提取