[发明专利]猪视网膜上皮细胞系及其建立方法和应用

权利要求书

1.猪视网膜上皮细胞系，其特征在于：所述猪视网膜上皮细胞系保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：C2020112，保藏日为2020年6月18日。

2.权利要求1所述的猪视网膜上皮细胞系的应用。

3.权利要求2所述的应用是指在生产猪圆环疫苗、猪流性腹泻疫苗、猪伪狂犬疫苗中的应用。

4.权利要求2所述的猪视网膜上皮细胞系在研究猪圆环病毒、猪流性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒在猪视网膜上皮细胞系细胞增殖中的应用。

5.权利要求2所述的猪视网膜上皮细胞系在分离或鉴定猪圆环病毒、猪流性腹泻病毒、猪伪狂犬病毒的应用。

6.权利要求3所述的应用，其特征在于：所述疫苗为猪圆环病毒疫苗抗原、猪伪狂犬病毒疫苗抗原或猪流行腹泻病毒疫苗抗原。

7.权利要求1所述猪视网膜上皮细胞系的建立方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)原代培养：获取猪眼球组织，无菌条件下剥离出视网膜，采用组织块贴壁培养法，分离获得高活力的猪视网膜细胞，经培养获得原代猪视网膜细胞；

(2)转染和筛选：将含有猪腺病毒E1基因的真核表达质粒pCI-neo-E1导入步骤(1)的原代猪视网膜细胞；

(3)筛选和扩大培养：待细胞转染pCI-neo-E1细胞汇合至80％时，使用胰酶消化后按1:1传代，然后G418筛选直到阳性克隆细胞可见，然后将细胞稀释后按每孔数量≤2个接种，待单细胞长出克隆团后，用胰酶进行消化，传代后继续扩大培养，继续利用G418筛选，得到抗G418的阳性细胞，接着将抗G418的阳性细胞体外连续传代培养，培养超过60代，获得稳定传代的猪视网膜上皮细胞系。