[发明专利]用于杜鹃属物种鉴定的引物、试剂盒和方法

说明书

本发明涉及一种用于杜鹃属物种鉴定的PCR扩增引物、试剂盒以及方法，所述引物选自以下至少一对：SEQ ID NO.19与SEQ ID NO.20所示序列，或其互补序列；SEQ ID NO.21与SEQ ID NO.22所示序列，或其互补序列。本发明的通过找到适合杜鹃花属的鉴定的方法，获得能签别杜鹃花属的目的核酸位置，并设置了理想的引物，从而能实现对杜鹃花属物种间的有效鉴别。

技术领域

本发明属于植物物种鉴定领域，具体地，涉及用于杜鹃属物种鉴定的引物、试剂盒和方法。

背景技术

传统的中药鉴别方法主要包括基原鉴定、性状鉴定、显微鉴定和理化鉴定。这四种方法主要依据药材的表型特征进行鉴定，而这些特征往往不仅受到遗传因素的影响，更与生物体的生长发育阶段、外部环境条件、人类活动(如引种驯化、加工炮制)等有密切关系，从而具有很大的变异性和可塑性，也因此需要鉴定人员大量的积累和总结，导致该方法存在主观性强、重复性和稳定性差等缺点。

近年来，随着分子生物学技术在中药鉴定的渗透与发展，基于DNA序列的分子鉴定技术得到了迅速的发展和应用，该方法与传统的中药鉴定方法相比较，通用性强、鉴定结果重复性好、数据容易整合、便于标准化推广。

中药分子鉴定技术主要包括3大类：一是基于PCR的DNA指纹技术，如RAPD等，该方法不需具备种属特异性，不同的物种基因组可使用同一套引物分析，但RAPD对反应条件非常敏感，实验结果重复性较差；二是基于分子杂交的DNA鉴定技术，如RFLP，该方法所需DNA量较大且对纯度要求较高；三是基于序列分析的DNA鉴定，如DNA条形码等技术，是目前中药鉴定中研究和应用最多的方法。

DNA条形码技术可以与全球生物DNA条形码数据库整合，进行检索并准确鉴定，同时针对药材及基原的任何部位，都具有非常好的适用性和重复性。根据研究对象的DNA信息是否已知，基于PCR的分子鉴定技术分为随机简单限定引物PCR标记技术和特征引物的PCR标记技术，前者可通过特异条带法和聚类分析法实现中药材的准确鉴定，后者则需要获得特异性鉴别条带。位点特异性PCR技术属于后者，在《中国药典》(2010版)已经收录，目前在石斛、紫苏等植物来源的中药材鉴别中也得到广泛应用。其方法原理简单概括如下：首先针对已知待鉴别中药与混伪品基因序列进行比对分析，在确定正品的特异变异位点后，设计引物是将该位点的互补碱基设计在引物3‘端的最末端，这样正品可以扩增出特异性突变位点的基因扩增片段，但混伪品不能，从而实现真伪鉴别(韩建萍,宋经元,姚辉,等.中药材DNA条形码鉴定的基因序列比较[J].中国中药杂志,2012,37(08):1056-1061)。

DNA条形码技术基于通用的DNA片段和充分样本取样，通过两两比较种类变异和中间变异的Barcoding Gap(遗传间隔)，对物种进行区分。陈士林等学者建立了以ITS2为核心序列、trnH-psbA为补充序列的植物类药材DNA条形码鉴定体系。中国植物条形码研究组分析发现，ITS与matK、rbcL和psbA-trnH三个叶绿体DNA条形码片段任一组合可有效区分70-79％的物种(郑硕理,田晓玲,黄承玲,等.结合分子手段和形态分析验证大白杜鹃与马缨杜鹃的自然杂交[J].生物多样性,2017,25(06):627-637.)。

中国是世界杜鹃花的起源和分布中心，杜鹃花野生资源品种丰富，光是特有种就有409种。但杜鹃花属植物种类繁多，部分种间亲缘关系较近，且自然界普遍存在自然杂交现象(刘仁林,曹利民,肖红.新变种上犹杜鹃的ITS分子标记证据分析[J].广西植物,2009,29(05):576-580)，导致一些物种形态特征及其相似，采用传统形态分类法也难以科学界定种、亚种、变种自和杂交种。目前，杜鹃属分子鉴别研究还薄弱，多集中在非药用品种。