[发明专利]一种芯片上恒温扩增测序的方法

权利要求书

1.一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤，

(1)将微球固载到基因测序芯片的表面

所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物，并且至少一种扩增引物的序列上含有剪切位点；

所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团,利用固载基团将微球固载到基因测序芯片的表面；

(2)杂交，延伸，解旋，清洗

将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；

加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；

解旋，并且清洗解旋下的扩增模板片段，得到微球表面带有与扩增模板互补配对的DNA链；

(3)恒温扩增

加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增，生成固定在芯片上的多个双链模板DNA；

加入剪切试剂，通过作用于含有剪切位点的扩增引物，选择性去除扩增后的双链模板DNA中的第二链；

加入封端试剂，将微球表面的DNA链或扩增引物的3’端进行封堵；

(4)测序

杂交测序引物，对芯片上的第一链进行测序。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：其中所述微球上修饰有两种扩增引物，并且连接有固载用基团；扩增模板的两端含有公共的接头序列，接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的；接头序列2和第二扩增引物至少部分序列是相同的。

3.一种芯片上恒温扩增测序的方法，其特征在于，包括以下步骤，

(1)将微球固载到基因测序芯片的表面

所述的微球表面预先连接了两种恒温扩增引物，即第一扩增引物和第二扩增引物；

所述微球的表面还预先修饰了固载用的基团；

(2)杂交，延伸

将扩增模板杂交到微球上，所述的扩增模板两端含有公共的接头序列，即接头序列1和接头序列2，所述接头序列1和第一扩增引物，至少部分序列是互补配对的，扩增模板的接头序列1与微球上的第一扩增引物杂交；

加入含有DNA聚合酶的反应液，扩增引物在聚合酶的作用下延伸，形成与扩增模板互补配对的DNA链；所述含有DNA聚合酶的反应液中含有dNTP；

(3)恒温扩增

加入恒温扩增试剂，在重组酶存在的条件下，进行微球表面扩增；

(4)测序

杂交测序引物，测序。

4.根据权利要求1所述的方法，所述基因测序芯片的至少一个内表面有阵列排布的微坑。

5.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：优选地，所述扩增为恒温扩增。

6.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于：优选地，所述扩增为重组酶聚合酶扩增(RPA)、重组酶介导等温核酸扩增(RAA)、桥式扩增中的一种。

7.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述扩增引物的长度为20-45bp。

8.根据权利要求1-4任一项所述的方法，其特征在于，所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述基因测序芯片上有修饰的链霉亲和素；通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到基因测序芯片上。

9.根据权利要求1-8任一项所述的方法，其特征在于，所述微球的直径为0.3-5微米，优选0.5-4微米，更优选1-2微米。

10.一种基因测序方法，其特征在于，将待测的DNA分子打断成50-2000bp的片段，作为扩增模板，按照权利要求1-9任一项所述的方法测序。