[发明专利]一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法

权利要求书

1.一种芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)将与固载在芯片上的引物互补的模板杂交到芯片上；所述模板在引物的3’端延伸出n nt，以供引物延伸，所述n为大于等于2的整数；

(2)芯片表面进行荧光发生测序反应，使每条引物上只延伸一个碱基，得到平均荧光增值int1；

(3)解旋；用末端转移酶TdT和ddNTP对引物进行封端；

(4)上述封端反应处理后的芯片，再次与所述模板杂交，进行荧光发生测序，加入的底物中含有A、C、G、T四种碱基，得到平均荧光增值int2；

(5)封堵效率由以下公式计算得到：

2.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述引物的长度为20～45nt。

3.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述n为大于等于2的整数，优选10～20。

4.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述使每条引物上只延伸一个碱基的具体方式为：测序反应时，加入的底物中仅含一种碱基，且该碱基为所述引物所延伸的第一个碱基。

5.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述封端所用试剂的组分为：TdT酶4μL，10x缓冲液40μL，CoCl₂ 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水308μL，总体积400μL；

或：TdT酶2.2μL，10x缓冲液40μL，CoCl₂ 40μL，ddNTP(10mM)8μL，水309.8μL，总体积400μL；

或：TdT酶20μL，10x缓冲液40μL，CoCl₂ 40μL，ddNTP(10mM)8μL，甘油160μL，水132μL，总体积400μL。

6.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述模板杂交的流程为：96℃，30s；-0.05℃/s；40℃，10s；25℃，forever。

7.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：封端反应后进行荧光发生测序反应时，加入的测序反应液由以下组分组成：荧光基团修饰的dA碱基，荧光基团修饰的dT碱基，荧光基团修饰的dC碱基，荧光基团修饰的dG碱基，荧光发生测序酶混合液和荧光发生测序缓冲液。

8.根据权利要求1所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述芯片表面固载有微球，所述微球上连接有引物。

9.根据权利要求8所述的芯片表面固相引物封堵效率的检测方法，其特征在于：所述微球上有生物素作为固载用的基团，所述芯片上有修饰的链霉亲和素，通过生物素和链霉亲和素的特异性反应将微球连接到芯片上。