[发明专利]一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用

说明书

本发明公开一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用，可视化混合染料包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1:1‑2；试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；试剂B中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。这种混合燃料用于LAMP检测中，与目前常见可视化染料相比，该可视化混合染料使LAMP反应结果更容易判断，阴性和阳性结果间颜色差异更加明显，极大程度避免了结果的判断，而且不需要复杂的仪器设备来辅助检测实验结果；另外，该可视化混合染料预先添加与LAMP反应体系中，在LAMP反应后，不必再打开PCR管盖，避免了对实验室环境造成核酸污染。

技术领域

本发明属于生物技术领域，尤其是涉及一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用。

背景技术

环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种近年来发展较快的核酸恒温扩增技术。它能够在恒定温度下对靶基因序列进行扩增，进而实现目的基因的快速检测，因其时间短、灵敏度高、特异性好和操作便捷等优点受到越来越多的关注。目前，LAMP结果的读取主要分为浊度检测、琼脂糖凝胶电泳检测和荧光/可视化染料检测等3类方法。但由于浊度检测和电泳检测都依赖于仪器并需要较复杂操作，因而可视化染料检测方法越来越受到专家学者的青睐。该方法只需在LAMP反应开始前于反应体系中加入染料，反应后，阴性反应试剂和阳性反应试剂即会呈现出明显的颜色差异，从而实现反应结果的快速判读。

目前，应用比较广泛的染料由以下两种：1)羟基萘酚蓝(Hydroxynaphthol Blue，HNB)，HNB作为金属离子指示剂，深紫色粉末，易溶于水和乙醇，也可作为LAMP反应可视化指示剂。在LAMP体系中提前加入HNB水溶液，起初镁离子与HNB结合使得反应液为紫色，随着反应的进行，Mg²⁺与析出的P₂O₇^4-反应生成Mg₂P₂O₇沉淀，HNB失去Mg²⁺使得体系颜色变为天蓝色，而未反应的体系则仍保持紫罗兰色；2)钙黄绿素(Calcein)，亮黄色粉末，溶于乙醇和碱，微溶于水，荧光指示剂，与Mg²⁺结合而成的复合物可产生强烈荧光，自然光下阴性、阳性结果间存在一定差异，但并不明显。首先在钙黄绿素中加入Mn²⁺，Mn²⁺使钙黄绿素的绿色荧光淬灭。当LAMP扩增反应发生后，产生的副产物焦磷酸离子与Mn²⁺结合并释放钙黄绿素，淬灭状态解除。最终呈现的结果为在365nm蓝光激发下，阳性反应发出强绿色荧光，阴性反应发出较弱绿色荧光。

上述两种染料通常被单独使用，但是它们存在一个极大的弊端，就是阴性和阳性结果之间颜色差异不够明显，或者需要仪器辅助判读结果，过程复杂。尤其是在自然光下，当目标基因浓度过低时，弱阳性结果与阴性结果难以区分，从而导致结果判读不准确。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供一种可视化混合染料及其在LAMP检测中的应用。

本发明采用的技术方案是：一种可视化混合染料，包括试剂A和试剂B，试剂A和试剂B体积比为1：2；

试剂A中含有钙黄绿素和氯化锰，钙黄绿素的浓度为500μM，氯化锰浓度为10mM；

试剂B中含有羟基萘酚蓝，羟基萘酚蓝浓度为0.32mM。

优选地，试剂A和/或试剂B由去核酸酶水制备得到。

可视化混合染料在LAMP检测中的应用。

优选地，在LAMP反应前预先加入到LAMP反应体系中。

优选地，LAMP扩增前，反应体系呈灰蓝色；

LAMP扩增结束后，阳性反应体系为天蓝色，阴性反应体系为紫罗兰色。