[发明专利]维生素D3 C-25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用

说明书

本发明涉及一种维生素D3 C‑25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用，属于酶工程技术和基因工程技术领域。维生素D3 C‑25位P450羟化酶CYP109E1‑H的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，并将基因cyp109E1‑H插入pMA5质粒中，以枯草芽孢杆菌WB600为表达宿主构建菌株，实现了维生素D3 C‑25位P450羟化酶CYP109E1‑H的异源表达，且成功实现了对维生素Dsubgt;3/subgt;的高效转化，同时专一性高，减少反应副产物，降低了生产成本，为其进一步的工业化应用奠定基础。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，尤其涉及一种维生素D3 C-25位P450羟化酶及其基因、表达载体、菌株及应用。

背景技术

在人体内，维生素D主要以维生素D₃形式存在，维生素D₃是最重要的维生素D族化合物。维生素D₃(VD₃)是没有活性的，只有转化成有活性的代谢产物才能发挥作用。维生素D3的活性衍生物主要有25(OH)VD₃(骨化二醇)、1α,25(OH)₂VD₃(骨化三醇)等。维生素D₃在肝脏中代谢可形成代谢产物25(OH)VD₃，在体内吸收速度很快，性质稳定且半衰期长。因此，25(OH)VD₃被作为衡量体内可利用维生素D水平的最佳指标。25(OH)VD₃是获得美国食品药品管理局(FDA)认证的一般公认安全级(GRAS)维生素D₃代谢物，在临床上用于治疗甲状腺功能衰退、牛皮癣、慢性肾功能衰竭、骨质疏松症、佝偻病、骨软化症等代谢性骨病的治疗，以及血液透析所致的低血钙症，使血清钙水平增高。除此之外，在饲料添加剂等方面也有广泛应用。

传统生产25(OH)VD₃是化学合成法，由Zhu等提出的以胆固醇及相关衍生物为原料，通过多步化学反应。但是化学合成法步骤多、转化率低，污染大且过程复杂。因此微生物转化法生产25(OH)VD₃具有广泛的应用前景。研究表明，一些微生物能够将维生素D3转化成骨化二醇和骨化三醇，曾志刚等(放线菌SIIA243对维生素D3的羟基化研究[J].中国抗生素杂志,2014,39(2):114-117.DOI:10.3969/j.issn.1001-8689.2014.02.009.)采用放线菌SIIA243对维生素D₃进行羟基化，得到25(OH)VD₃和1α,25(OH)₂VD₃。但得到的混合产物后续分离纯化步骤复杂，且纯度不高。因此，仍需一种高纯度生产25(OH)VD₃的方法。付跃等(生物法生产25-羟基维生素D3条件优化[J].安徽农业科学,2017(2).DOI:10.3969/j.issn.0517-6611.2017.02.003.)采用放线菌UV-FY-141进行发酵，通过优化发酵条件，确定发酵培养基的组成为葡萄糖15.00g，蛋白胨20.00g，NaCl 5.00g，CaCO₃ 2.00g，FeSO₄·7H₂O 0.01g，去离子水1000mL，优化后转化条件为发酵初始pH为6.5，发酵温度为28℃，摇床转速为200r/min，发酵时间为72h，使25(OH)VD₃的产量提高到13.13mg/L。但以上方法存在纯度低、产量低、生产成本高等问题。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种维生素D3 C-25位P450羟化酶，其可以介导选择性催化底物维生素D₃生成产物25(OH)VD₃的过程，对25(OH)VD₃的高效生产具有重要意义。

本发明的第一个目的是提供一种维生素D3 C-25位P450羟化酶，该维生素D3 C-25位P450羟化酶可催化维生素D₃的C-25位羟基化，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。