[发明专利]一种检测miRNA的CDA探针引物组、试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种检测miRNA的CDA探针引物组、试剂盒及其应用。所述CDA探针引物组包括：探针1、探针2、引物MF、引物MR；探针1从3’到5’端分别由R1c区和T1区组成，探针2从3’到5’端分别由T2区、M区和F1区组成，引物MF由F1区和M1c区组成，引物MR由R1区和M2区组成；其中T1区与待测miRNA的部分序列互补，T2区与待测miRNA的另一部分序列互补，T1和T2两部分与完整的待测miRNA序列互补；所述M区包括M1区和M2区，M1区与M1c区互补，M2区与M2c区互补，R1区与R1c区互补，F1区与F1c区互补；所述探针1的5’端被磷酸化修饰。本发明提供的方法或试剂盒无需昂贵的仪器、也无需复杂的操作即可完成对miRNA的快速准确检测。

技术领域

本发明属于生物检测技术领域，具体涉及一种检测miRNA的CDA探针引物组、试剂盒及其应用。

背景技术

微小核糖核酸(microRNAs或miRNAs)是一类内生的、长度约20-24个核苷酸的小RNA，其在细胞内具有多种重要的调节作用。其复杂的调节网络系统表现在既可以通过一个microRNA来调控多个基因的表达，也可以通过几个microRNAs的组合来精细调控某个基因的表达。学术研究已经证明，人类已知癌症的发生发展与microRNA的表达失调有着直接联系。

最常用的microRNA检测方法是NorthernBlot，也被认为是microRNA检测和确认的金标准。该方法是经典的探针杂交检测法，特异性和灵敏度不高。现有基于RT-PCR的microRNA商业检测试剂盒主要为基于polyA加尾和颈环结构介导等的信号转换技术，这些试剂盒在目前的应用中操作繁琐、通量较低。

现在，对microRNA检测新技术的研究主要基于恒温扩增、核酸酶、纳米技术、量子点的等信号放大方法。其中，环介导恒温扩增(LAMP)反应作为特异性和灵敏度均非常高的恒温扩增反应，研究者亦探索了其在microRNA检测方面的应用。基于闭合颈环介导的核酸恒温扩增技术(Closed Dumbbell mediated Isothermal Amplification of nucleicacids，CDA)是由中国科学院大学宁波生命与健康产业研究院开发的新方法，可替代日本LAMP核酸扩增方法(中国专利申请号：202110473121.8)。该方法主要利用2种不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在等温条件进行扩增反应。与常规基因检测手段(如PCR等)相比，CDA反应在恒温水浴箱内便可完成，对仪器设备的要求较低，且操作简单，非专业人士也可准确地完成，适合于基层医疗机构及地方检验检疫部门。

发明内容

本发明的目的是，提供一种检测miRNA的CDA探针引物组、试剂盒及其应用。旨在解决现有技术中miRNA检测操作复杂，灵敏度不高的技术问题。

本发明为解决上述技术问题所采用的技术方案如下：

一种非疾病诊断目的的检测miRNA的CDA探针引物组，该探针引物组包括：探针1、探针2、引物MF、引物MR；探针1从3’到5’端分别由R1c区和T1区组成，探针2从3’到5’端分别由T2区、M区和F1区组成，引物MF由F1区和M1c区组成，引物MR由R1区和M2区组成；其中T1区与待测miRNA的部分序列互补，T2区与待测miRNA的另一部分序列互补，T1和T2两部分与完整的待测miRNA序列互补；所述M区包括M1区和M2区，M1区与M1c区互补，M2区与M2c区互补，R1区与R1c区互补，F1区与F1c区互补；所述探针1的5’端被磷酸化修饰。所述F1区、M区、R1区其具体序列可为设计的任意序列，各区长度约为20bp左右。

参见图1，为探针1和探针2通过miRNA合成CDA反应模板的示意图。

本发明还提供一种检测miRNA的试剂盒，该试剂盒包括所述的CDA探针引物组。