[发明专利]一种检测miRNA的CDA探针引物组、试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种非疾病诊断目的的检测miRNA的CDA探针引物组，该探针引物组包括：探针1、探针2、引物MF、引物MR；探针1从3’到5’端分别由R1c区和T1区组成，探针2从3’到5’端分别由T2区、M区和F1区组成，引物MF由F1区和M1c区组成，引物MR由R1区和M2区组成；其中T1区与待测miRNA的部分序列互补，T2区与待测miRNA的另一部分序列互补，T1和T2两部分与完整的待测miRNA序列互补；所述M区包括M1区和M2区，M1区与M1c区互补，M2区与M2c区互补，R1区与R1c区互补，F1区与F1c区互补；所述探针1的5’端被磷酸化修饰。

2.一种检测miRNA的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括权利要求1所述的CDA探针引物组。

3.如权利要求2所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括核酸链连接反应液和CDA扩增反应液，其中核酸链连接反应液包括核酸链连接酶、反应缓冲液、探针1、探针2；所述CDA扩增反应液包括引物MF和引物MR、Bst聚合酶、CDA反应缓冲液、超纯水。

4.如权利要求3所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述核酸链连接反应液的组成为：

3-7U T4 RNA连接酶2

1X T4 RNA连接酶2反应缓冲液

100-2000nM探针1

100-2000nM探针2。

5.如权利要求3所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于：所述CDA反应缓冲液包括Tris-HCl、KCl、(NH₄)₂SO₄、MgSO₄和Triton X-100。

6.如权利要求3所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于：所述CDA扩增反应液还包括显色剂，所述显色剂选自SYBR green I、Eva green、羟基萘酚蓝、铬黑T中的一种。

7.如权利要求3所述的检测miRNA的试剂盒，其特征在于，所述CDA扩增反应液的组成为：

2-50mM Tris-HCl pH8.8

2-20mM KCl

2-20mM(NH₄)₂SO₄

2～20mM MgSO₄

0.1～0.5％TritonX-100

0.2～1M甜菜碱

1～1.6mM dNTP

5～10U Bst DNA聚合酶

100～150μmol/L显色剂

1～2μM引物MF

1～2μM引物MR；

反应溶剂为超纯水。

8.权利要求3所述试剂盒非疾病诊断目的的检测miRNA的方法，包括以下步骤：

步骤1，将核酸链连接酶和反应缓冲液、探针1、探针2混合，制得核酸链连接反应液；制得的核酸链连接反应液于35-38℃反应50-70min。

步骤2，将步骤1反应完毕的核酸链连接反应液与CDA扩增反应液混合，于60～65℃反应20～80min，根据扩增结果判断样品中是否含有miRNA。

9.权利要求1所述的CDA探针引物组在非疾病诊断目的的miRNA检测中的应用。

10.权利要求2-7任一项所述的试剂盒在非疾病诊断目的的miRNA检测中的应用。