[发明专利]基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用

说明书

本发明公开了一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用，在I‑R3DNAzyme催化核心区引入甲基残基；与Substrate退火杂交，与去甲基化酶反应恢复DNAzyme的切割活性；加入锌离子，切割Substrate的特定位点，释放出靶向Cas12a/crRNA的序列；加入含有非特异单链的Cas12a报告溶液，靶向激活Cas12a，Cas12a切割带荧光基团和淬灭基团的非特异性单链，使得荧光基团恢复荧光信号，通过监测荧光信号的变化达到检测去甲基化酶活性的目的。本发明的检测方法可以实现检测信号的多重放大，可实现多种去甲基化酶的检测以及对烷基化药物的疗效进行评估。

技术领域

本发明涉及生物医学检测领域，具体涉及一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用。

背景技术

烷基化剂是许多癌症常用的化学药物。当烷基化试剂攻击基因组DNA时，烷基化损伤发生在不同的易感位点，如O⁶-甲基鸟嘌呤(O⁶MeG)、N¹-甲基腺苷(1MeA)和N³-甲基胞嘧啶(3MeC)，影响核酸和蛋白质的结构和功能，干扰转录和复制。虽然有一些烷化剂是有效的，但烷化剂耐药性一直是影响肿瘤靶向药物疗效的重要问题。造成这种耐药性的主要因素之一是存在许多内源性去甲基酶，它们修复烷化剂造成的损伤，使癌细胞对烷化剂产生耐药性。其中，O⁶-甲基鸟嘌呤DNA甲基转移酶(MGMT)和AlkB同源蛋白(ALKBH)家族被认为是去甲基化蛋白中的两类关键的蛋白，它们在癌症治疗中肿瘤对烷基化药物的化疗耐药性中发挥着重要作用。MGMT是一种DNA修复酶，属于转移酶家族。它按1:1化学计量关系将O⁶MeG上的烷基加合物转移到自己的半胱氨酸残基来修复DNA中的烷基化鸟嘌呤。研究显示，烷化剂的治疗效果与MGMT表达呈负相关。因此，MGMT活性是评价烷基化药物疗效的重要指标。到目前为止，已经报道了几种检测MGMT活性的方法，包括常用的甲基化特异性PCR(MSP)和MGMT活性测试。然而，前者依赖于间接分析MGMT启动子甲基化水平，该甲基化与MGMT活性只有适度的相关性；而后者是一种半定量分析方法，缺乏灵敏性。

脱氧核糖核酶(DNAzyme)是通过DNA文库筛选出来的催化核酸，与蛋白质酶或核酶相似，DNAzyme可以催化许多化学和生物转化，如DNA或RNA切割、连接、磷酸化等，其中一些DNAzyme需要特定的辅助因子，如氨基酸、金属离子和有机小分子等，使DNAzyme成为开发高选择性生物传感器的新平台。前期研究表明，DNAzyme催化核心的碱基序列高度保守，这对维持其催化活性至关重要。在此基础上，对DNAzyme进行化学修饰可以调节其催化活性，使其作为一种功能性开关用于开发更多调控型生物化学传感平台。

CRISPR-Cas12a(Cpf1)可以与单链引导RNA(crRNA)结合形成Cas12a/crRNA复合体，不仅像许多其他CRISPR-Cas系统一样切割靶DNA，而且被靶DNA激活后，Cas12a可以切割体系中任何非特异性的单链DNA。大多数Cas12a系统结合了高效的非特异性ssDNA切割技术和核酸扩增技术，检测限低至fM级别，在核酸相关疾病诊断方面具有巨大潜力。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用。该检测方法基于一种表观遗传修饰敏感DNAzyme和CRISPR/Cas12a的信号放大技术，可以实现检测信号的多重放大。同时，该检测方法可实现多种去甲基化酶的的检测以及对烷基化药物的疗效进行评估。

为了实现上述目的，本发明提供了一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法，包括以下步骤：

S1、在I-R3 DNAzyme催化核心区引入甲基残基获得甲基化的DNAzyme；将所述DNAzyme与Substrate退火杂交，然后与去甲基化酶共孵育过夜反应以去除DNAzyme上的甲基，恢复切割活性；