[发明专利]基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法和应用

权利要求书

1.一种基于脱氧核糖核酶的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、在I-R3 DNAzyme催化核心区引入甲基残基获得甲基化的DNAzyme；将所述甲基化的DNAzyme与Substrate退火杂交，然后与去甲基化酶共孵育以去除DNAzyme上的甲基，恢复切割活性；

S2、加入锌离子形成DNAzyme切割反应体系，切割所述Substrate的特定位点，释放出可靶向Cas12a-crRNA的序列；

S3、加入含有非特异性单链的Cas12a报告溶液，所述可靶向Cas12a-crRNA的序列靶向激活Cas12a，从而切割所述非特异性单链，获得荧光信号，通过监测荧光信号的变化达到检测去甲基化酶活性的目的。

2.根据权利要求1所述的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述S1中所述引入甲基残基包括O⁶MeG、m6A、1MeA、3MeC中的一种或多种。

3.根据权利要求1所述的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述S1中所述去甲基化酶为MGMT、ALKBH2、FTO中的一种或多种；所述DNAzyme为DNAzyme1～DNAzyme8，DNAzyme1.1-4.1中的一种，所述Substrate为Substrate1～Substrate3中的一种；

所述DNAzyme1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

所述DNAzyme2的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述DNAzyme3的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示；

所述DNAzyme4的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示；

所述DNAzyme5的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述DNAzyme1.1的核苷酸序列入SEQ ID NO.6所示；

所述DNAzyme2.1的核苷酸序列入SEQ ID NO.7所示；

所述DNAzyme3.1的核苷酸序列入SEQ ID NO.8所示；

所述DNAzyme4.1的核苷酸序列入SEQ ID NO.9所示；

所述DNAzyme6的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述DNAzyme7的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述DNAzyme8的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；

所述Substrate1的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示；

所述Substrate2的核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示；

所述Substrate3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示。

4.根据权利要求1所述的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述S3中所述非特异性单链为携带有荧光基团和淬灭基团的ssDNA，所述ssDNA的序列如SEQ ID NO.17所示。

5.根据权利要求1所述的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述Cas12a报告溶液包括crRNA和Cas12a，所述crRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示。

6.根据权利要求5所述的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述Cas12a报告溶液的成分还包括：50mM HEPES、100mM NaCl、20mM MgCl₂，pH 7.4。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的去甲基化酶活性检测方法，其特征在于，所述S1具体为：

S1-1、将DNAzyme与Substrate混合于去甲基化反应的缓冲体系中，置于95℃反应5min；

S1-2、加入去甲基化酶或细胞裂解液，37℃过夜反应。