[发明专利]生产L-缬氨酸的重组微生物及构建方法、应用

权利要求书

1.一种生产L-缬氨酸的重组微生物的构建方法，其特征在于，向微生物中导入NADH依赖型乙酰羟酸异构还原酶基因kari和NADH依赖型氨基酸脱氢酶基因leuDH，使得所述酶活性增强。

2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：还包括对权利要求1所述的重组微生物进行以下(a)-(h)中任一种改造：

(a)进行第(1)-(7)中任一项改造；

(b)进行第(1)-(6)中任几种组合改造；

(c)进行第(1) -(6)中任一项，与第(7)项的组合改造；

(d)进行第(1)、(2)、(3)、(4)、(6)中任几项，与第(7)项的组合改造；

(e)进行第(1)、(3)、(4)、(6)中任一项，与第(5)和(7)项的组合改造；

(f)进行第(1)、(2)、(3)、(4)、(6)中任两项，与第(5)和(7)项的组合改造；

(g)进行第(1)、(2)、(3)、(4)、(6)中任三项，与第(5)和(7)项的组合改造；

(h)进行第(1)、(2)、(3)、(4)、(6)中任四项，与第(5)和(7)项的组合改造；

其中，所述第(1)、(2)、(3)、(4)、(5)、(6)、(7)项的改造方案如下：

(1) 敲除mgsA基因；

(2) 敲除ldhA基因；

(3) 敲除pta和/或ackA基因；

(4) 敲除tdcD和/或tdcE基因；

(5) 敲除adhE基因；

(6) 敲除frd和/或pflB基因；

(7) 增强乙酰乳酸合成酶AHAS和/或二羟酸脱水酶ilvD的活性。

3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：所述AHAS为ilvBN或ilvGM或ilvIH。

4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于：所述ilvIH的AHAS的活性通过解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制得到增强。

5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于：采用突变ilvH基因的方式解除缬氨酸对ilvIH的反馈抑制。

6.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：以ilvD基因替换微生物本身的pflB基因的方式实现第(6)项。

7.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：以leuDH基因替换微生物本身的frd基因的方式实现第(6)项；

8.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：以kari基因替换微生物本身的adhE基因的方式实现第（5）项；

9.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：以ilvC基因替换微生物本身的mgsA基因的方式实现第（1）项，且ilvC在导入后任选地可再次敲除。

10.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于：所述的微生物为大肠杆菌。

11.根据权利要求10所述的构建方法，其特征在于：所述的微生物为大肠杆菌ATCC8739。

12.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于：使用至少一个调控元件增强所述酶基因的活性；

13.根据权利要求12所述的构建方法，其特征在于：所述调控元件选自M1-46人工调控元件、M1-93人工调控元件或RBS5人工调控元件。

14.根据权利要求13所述的构建方法，其特征在于：

M1-46人工调控元件调控ilvC基因；

M1-93人工调控元件调控ilvD、leuDH、ilvBN和ilvGM基因；

RBS5人工调控元件调控kari基因。