[发明专利]一种胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物合成中的应用

说明书

本发明公开了胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物合成中的应用。本发明公开的胺脱氢酶突变体，为对来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillus stearothermophilus)的胺脱氢酶（GsLDH）进行突变得到的蛋白质。本发明的胺脱氢酶突变体可以催化羟基酮底物合成以4‑羟基‑2‑丁酮为代表的手性胺醇化合物，操作方便，具有产物光学纯度高等优点，立体选择性可高达99%，在生物催化制备手性胺醇化合物具有较好的工业应用前景。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，涉及胺脱氢酶突变体及其在手性胺醇化合物中的应用。

背景技术

手性胺醇是合成许多重要药物的前体，被用来合成多种具有生物活性的化合物。其中(R)-3-氨基-1-丁醇是一种含有手性胺基团重要的手性药物中间体，在有机合成和制药领域应用非常广泛，可以用来合成抗肿瘤药物、抗艾滋病药物以及β-内酰胺衍生物。

目前，(R)-3-氨基-1-丁醇的合成主要通过化学法。已有文献报道，以手性(R)-丙氨酸为原料，经氨基保护后，重氮甲烷增长碳链变为β-氨基酸酯，脱保护后还原得到目标产物。该方法的缺点是高手性纯度的(R)-丙氨酸较难得到，重氮甲烷使用危险，不适合规模化工业化生产。以巴豆酸酯与(R)-(+)-α-苯乙胺为底物进行反应生成具有两个手性中心的一组差向异构体，通过硅胶柱层析分离后得到单一的异构体，然后经过酯还原、脱苄基得到(R)-3-氨基-1-丁醇。该路线步骤较少，原料易得，但是存在反应选择性较差，分离纯化困难，还原剂价格昂贵，因此不适合规模化生产。以3-丁酸乙酯为原料，经生物还原法得到3-(S)-丁酸乙酯，并在其后的反应步骤中在Witsunobu试剂催化下与酞酰亚胺反应，发生Walden转化，成功的把3-(S)构型改变为所需要的3-(R)构型中间体，并得到最终目的标物。但是，冗长的合成路线，使用比较昂贵的Witsunobu试剂和价格既贵又具危险性的四氢铝锂等众多因素使其难以实现产业化。

综上所述，化学法合成(R)-3-氨基丁醇存在原料短缺，成本高，高温高压反应条件，污染环境，安全性低，

因此，寻找绿色方法来合成手性胺醇，尤其是(R)-3-氨基-1-丁醇，对促进现有化学工艺的绿色升级和加强对环境的保护具有重要的工业应用价值。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何高效制备手性胺醇化合物。

为解决以上技术问题，本发明首先提供了一种胺脱氢酶突变体(也称为GsAmDH突变蛋白质)，在SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第43、68、114、134、146、187、261、291、294位存在替换突变。其中野生型的胺脱氢酶来源于嗜热脂肪地芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus)，其是uniprot：P13154(GsLDH)，而SEQ ID No.1所示氨基酸序列是在所述野生型序列上进行K68S和D261L两个位点突变获得的(称为GsAmDH)。任选地还可以增加有标签序列，如增加组氨酸标签等便于操作。

所述突变胺脱氢酶是SEQ ID No.1所示氨基酸序列上存在选自如下九种的任一种、任两种、任三种、任四种、任五种、任六种、任七种、任八种或全部突变得到的蛋白质：

X1、将GsAmDH第43位的苏氨酸残基突变为甲硫氨酸残基；

X2、将GsAmDH第68位的赖氨酸残基突变为丝氨酸残基；

X3、将GsAmDH第114位的谷氨酸残基突变为缬氨酸残基、半胱氨酸残基或亮氨酸残基；

X4、将GsAmDH第134位的苏氨酸残基突变为甘氨酸残基或半胱氨酸残基；

X5、将GsAmDH第146位的脯氨酸残基突变为缬氨酸残基；

X6、将GsAmDH第187位的组氨酸残基突变为天冬氨酸残基；