[发明专利]一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种基于光控的CRISPR‑Cas核酸检测试剂盒及检测方法，该试剂盒包括沉默引导RNA和Cas蛋白；沉默引导RNA是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区和间隔区两个区域；沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；沉默核苷酸的碱基之间采用PC linker连接；Cas蛋白为Cas12蛋白或Cas13蛋白。本申请将核酸扩增和CRISPR‑Cas检测在时间上分开，但是可以实现在一个试管里面封闭完成，避免了开盖试剂转移过程，在确保高的检测灵敏度的同时，又保证了检测不受气溶胶污染影响。

技术领域

本发明属于生物检测领域，具体涉及一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法。

背景技术

目前，CRISPR-Cas系统，如CRISPR-Cas12和CRISPR-Cas13系统，已广泛地应用于核酸诊断领域，但是单独的CRISPR-Cas检测体系灵敏度仍然难以达到PCR的水平，所以当前基于CRISPR-Cas发展起来的核酸检测方法绝大多数要结合核酸扩增。

在将核酸扩增和CRISPR-Cas识别体系结合到单个试管的检测方法中，因为CRISPR-Cas检测体系将识别并切割靶核酸，所以会导致扩增模板的断裂，从而降低扩增效率。另一方面，在扩增过程当中，初期扩增产物也会被CRISPR-Cas检测体系识别并切割，从而导致可被循环使用的模板的断裂，导致扩增效率下降。

这些因素导致现有的基于CRISPR-Cas的单管核酸检测技术仍然效率较低，满足不了高灵敏度的核酸检测要求。

由于这些原因，很多报道的基于CRISPR-Cas的核酸检测技术将核酸扩增过程和CRISPR-Cas检测过程分步进行。但是分步过程会涉及到反应试管的开盖和液体转移，这些过程将容易引起气溶胶污染，从而导致假阳性。因此，发展能提高CRISPR-Cas系统灵敏度的单管检测方法是本领域重要的科学课题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒及检测方法，将核酸扩增和CRISPR-Cas检测在时间上分开，又可以在一个试管中封闭完成，避免了开盖试剂转移过程，在确保高检测灵敏度的同时，保证了检测不受气溶胶污染影响。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种基于光控的CRISPR-Cas核酸检测试剂盒，包括沉默引导RNA和Cas蛋白；

所述的试剂盒还包括荧光报告探针、扩增引物、酶或缓冲液中的一种以上；

所述的沉默引导RNA，是由沉默核苷酸和引导RNA通过退火杂交形成；

所述引导RNA是根据靶标核酸序列设计的，包含重复区(repetitive sequence)和间隔区(spacer sequence)两个区域，引导RNA与Cas蛋白结合形成蛋白核酸复合物，引导蛋白核酸复合物识别并切割靶标核酸；

所述沉默核苷酸的碱基之间采用可被光激活降解的PC linker连接；

所述沉默核苷酸与引导RNA的间隔区序列完全互补配对，或者与引导RNA的重复区序列完全配对；

优选地，所述沉默核苷酸除了与引导RNA间隔区序列完全互配之外，还往重复区多配对若干个(1-21个)碱基，优选多配对5个碱基；

所述沉默核苷酸中可以含有1-6个PC linker，优选含有3个PC linker；

所述沉默核苷酸中，每隔5-10个碱基嵌入一个PC linker；优选每隔6个碱基嵌入一个PC linker；

所述沉默核苷酸与引导RNA的摩尔浓度比为(1～2):1，优选2:1；