[发明专利]一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法

说明书

本发明公开了一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，涉及原核细胞表达技术领域，包括以下步骤：植物材料准备，对红米稻进行无菌消毒，进行培养箱培养，取少量无菌红米稻幼苗样品，采用Trizol法提取红米稻总RNA；RT‑PCR扩增目的基因，目的基因与重组表达载体连接，重组载体转化大肠杆菌细胞，目的蛋白大肠杆菌诱导表达与检测，本发明采用现代基因工程策略，通过对红米稻总RNA提取、RT‑PCR扩增目的基因。将目的基因与重组表达载体连接，再重组载体转化大肠杆菌细胞，实现红米稻中一个血红素结合相关的目的蛋白基因在原核细胞大肠杆菌中高效表达，为该类型植物源性血红素结合相关蛋白的大量获得及其活性鉴别和运用提供了关键技术条件和基础。

技术领域

本发明涉及原核细胞表达技术领域，具体涉及一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法。

背景技术

血红素是四吡咯化合物(tetrapyrroles)家族的重要成员之一。随研究深入，现已发现人类和哺乳动物细胞内血红素的功能重要且多样。其不仅作为血红蛋白重要的辅基，而且参与氧的代谢与转运、细胞内电子转移等调节。多数情况下体内非游离的血红素往往和蛋白亚基相互作用形成复合物，发挥其调节功能。但是，游离血红素过多却可诱发产生活性氧进而造成细胞氧化应激损害。因此，细胞内血红素须受酶或特定蛋白等作用调节以维持相对稳定。血红素结合相关蛋白(heme binding-related proteins，HBP)，包括血红素氧合酶等是参与血红素调节的关键因子。植物血红素较难溶于水分，需要借助其辅基蛋白转运到功能组织部位。因此，植物来源性血红素辅基蛋白，包括血红素结合和转运蛋白对血红素正常发挥功能具有重要作用。水稻是我国第一大粮食作物，而有色稻是我国重要的稻米种资源。比如，红米作为我国古老而珍贵的稻种资源，因其糙米皮具有红色沉淀而得名，是药食同源的滋补珍品。新形势下，运用生物技术方法发现内源活性蛋白因子对于深入开发红米稻遗传资源、促进其资源利用具有重要意义。例如，加强资源性稻米中的血红素结合相关蛋白或酶的基因研究，鉴定其表达产物生物活性，将可为进一步开发和运用其有益于人体营养和健康方面的功能提供基础。

植物源性的血红素结合相关蛋白基因在植物体内对于增强植物抵抗生物和非生物胁迫方面具有重要潜能。其很可能借助抗氧化途径发挥功能。但目前对红米稻中的血红素结合相关蛋白研究很少，其体外有益活性待深入发掘。

发明内容

本发明的目的是提供一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，以解决现有技术中的上述不足之处。

为了实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，包括以下步骤：

步骤一、植物材料准备，对红米稻进行无菌消毒，置于培养皿无菌滤纸上保持一定湿度，进行培养箱培养，待萌发2-4d后作为红米稻幼苗样品；

步骤二、红米稻总RNA提取，取少量无菌红米稻幼苗样品，采用Trizol法提取红米稻总RNA；

步骤三、RT-PCR扩增目的基因，设计目的基因OsHBP2上、下游引物，上下游引物分别设计限制性核酸内切酶位点为BamH1和EcoR1，以反转录产物单链cDNA为模板扩增目的基因；

步骤四、目的基因与重组表达载体连接，对上述扩增产物进行乙醇沉淀回收，取回收产物和pColdⅠ载体分别进行限制性核酸内切酶消化，形成粘性末端，回收酶切表达载体及目的基因片段进行连接反应；

步骤五、重组载体转化大肠杆菌细胞，取连接体系中产物5μl，与大肠杆菌感受态细胞进行混合，冰浴20-40min后进行热激转化，复苏菌液涂浓度为100ug/ml的LB+Amp培养基，倒置平皿培养16h，观察并挑选单菌落进入液体LB培养，提取质粒和测序鉴定克隆子；