[发明专利]一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法

权利要求书

1.一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、植物材料准备，对红米稻进行无菌消毒，置于培养皿无菌滤纸上保持一定湿度，进行培养箱培养，待萌发2-4d后作为红米稻幼苗样品；

步骤二、红米稻总RNA提取，取少量无菌红米稻幼苗样品，采用Trizol法提取红米稻总RNA；

步骤三、RT-PCR扩增目的基因，设计目的基因OsHBP2上、下游引物，上下游引物分别设计限制性核酸内切酶位点为BamH1和EcoR1，以反转录产物单链cDNA为模板扩增目的基因；

步骤四、目的基因与重组表达载体连接，对上述扩增产物进行乙醇沉淀回收，取回收产物和pColdⅠ载体分别进行限制性核酸内切酶消化，形成粘性末端，回收酶切表达载体及目的基因片段进行连接反应；

步骤五、重组载体转化大肠杆菌细胞，取连接体系中产物5μl，与大肠杆菌感受态细胞进行混合，冰浴20-40min后进行热激转化，复苏菌液涂浓度为100ug/ml的LB+Amp培养基，倒置平皿培养10-20h，观察并挑选单菌落进入液体LB培养，提取质粒和测序鉴定克隆子；

步骤六、目的蛋白大肠杆菌诱导表达与检测，将测序正确的重组质粒导入表达菌株BL21感受态细胞中，进行0.1mM IPTG诱导，诱导表达1-5h，超声破碎细胞，离心分离裂解菌后的上清，与镍琼脂糖凝胶珠进行亲和结合，再进行咪唑溶液洗脱，对分次洗脱的样品收集，并制备电泳样品后进行SDS-PAGE凝胶电泳分析。

2.根据权利要求1所述的一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于：所述步骤一中对红米稻进行无菌消毒方法为使用2％次氯酸钠溶液消毒5min，无菌水反复冲洗4次。

3.根据权利要求1所述的一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于，所述步骤二中采用Trizol法提取红米稻总RNA的具体操作为：

取少量无菌红米稻幼苗样品置于预冷的研钵中，液氮研磨成粉末，加入Trizol抽提缓冲液，浸润后转入EP管中，上下颠倒2min，静置1min后加入氯仿200ul，用力震荡15秒混匀，静置3分钟后，12000rpm离心10分钟，吸取上清至新的ep管，加入500μl异丙醇，颠倒混匀，静置8min后，12000rpm离心10分钟；75％乙醇洗涤沉淀并晾干，用RNase-free ddH2O溶解并低温贮存样品。

4.根据权利要求1所述的一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于：

所述步骤三中上游引物为：OsHBP2-F CGGGATCCATGGGGATGGTGCTGGGCA；

下游引物为：OsHBP2-R CGGAATTCTCACTCGACGGGGACCAT。

5.根据权利要求1所述的一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于：所述步骤三中包括PCR反应程序，PCR反应程序为95℃3min，95℃30s，50℃30s，72℃45s，72℃5min，16℃10min，反应循环数设为30。

6.根据权利要求1所述的一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于：所述步骤四中，基因片段和pColdⅠ载体酶切反应体系为：载体或基因片段Ⅰ3.0μl，BamHⅠ1.0μl，EcoR1 1.0μl，10×H buffer 5.0μl，ddH2O(含RNase)40μl；将上述成分轻轻混匀后，37℃保温4小时，再回收酶切表达载体及目的基因片段进行连接反应，体系为DNA1.0μl，ddH2O 4.5μl，pCold I 0.5μl，Solution 0.5μl；16℃连接10小时。

7.根据权利要求1所述的一种红米稻血红素结合蛋白的原核细胞高效表达方法，其特征在于：所述步骤六中超声破碎细胞的破碎功率为66W，时间4～10s，重复3次，间隔10s。